一、前言
对于诺卡菌和马红球菌等需氧放线菌来说，全国很多的微生物室都曾经分离和鉴定过。然而，大多数情况下，我们只是根据《热病》及其他抗微生物治疗指南的相关内容，向临床提供该类细菌的用药建议，却很少有实验室能对其进行标准化的药敏实验和提供准确的药敏报告。
在临床微生物实验室，不能开展需氧放线菌药敏试验的原因有很多。当然，也有很大一部分原因在于，我们大多数检验人员可能并不清楚诺卡菌和马红球菌等需氧放线菌的药敏试验方法。本文对CLSIM24-A2中的相关内容进行了摘译和整理，供大家参考！
二、适应范围
临床上所说的需氧放线菌包括：诺卡菌（Nocardia)、马红球菌（Rhodococcusequi）及其他红球菌种、戈登菌(Gordonia)、冢村菌（Tsukamurella）和链霉菌属（Streptomyces）等。本文介绍的药敏实验方法适应用上述菌种。
三、试验方法和局限性
对于诺卡菌和红球菌等需氧放线菌，药敏试验方法推荐采用微量肉汤稀释法。但需要注意的是，微量肉汤稀释法具有一定的局限性，主要包括：
(1)头孢曲松的药敏结果很难被解释（未发表的数据），尤其是检测巴西诺卡菌（N.brasiliensis）时会出现头孢曲松的假耐药现象。
(2)对于皮疽诺卡菌（N.farcinica），亚胺培南常常会出现假耐药现象。
(3)对于磺胺药物而言，微量肉汤稀释法的结果也是难以解释的。因此，当使用微量肉汤稀释法进行药敏试验时，可以同时使用磺胺甲基异恶唑纸片进行扩散法药敏试验，以便解释分离菌株对磺胺药物的敏感性（未发表数据）；或者也可以在采用微量肉汤稀释法获得的MIC结果可疑时，加做纸片扩散法药敏试验。
（4）在需氧放线菌中，马红球菌是唯一能在大多数微量稀释法的药敏板中快速生长的细菌，马红球菌可以使用需氧革兰阳性菌药敏板（微量肉汤稀释法）；操作步骤按照CLSIM07中的描述去执行。此外，药敏板覆盖的药物中还应包含有万古霉素和利福平，因为这两种药物是治疗马红球菌感染的关键性药物。
四、抗菌药物选择
被推荐的抗菌药物如下：
一线药物
阿米卡星、阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、环丙沙星、克拉霉素、亚胺培南、利奈唑胺、米诺环素、莫西沙星、甲氧苄啶/磺胺甲基异恶唑、妥布霉素
二线药物
头孢吡肟、头孢噻肟、多西环素
需注意的是，对于马红球菌，除以上所列一线药物外，还推荐加测万古霉素和利福平，因为万古霉素和利福平在马红球菌的治疗中特别有效。
五、试验菌株和菌悬液制备
推荐使用血琼脂平板或胰酪胨大豆琼脂平板上生长的菌落来进行药敏试验。菌株接种平板后，在35±2℃、非二氧化碳培养箱中孵育，直到达到药敏试验所需的菌量，但需要注意培养时间最多不可超过7天。
接种的菌悬液要使用CAMHB肉汤来制备，试验所需的菌渡浓度为0.5麦氏浊度。其中马红球菌的药敏试验按照CLSIM07中描述革兰阳性菌的操作步骤去执行，而马红球菌以外的其他需氧放线菌以及诺卡菌，其菌悬液的制备方法如下：
(1)准备无菌微量离心管，加入少量无菌去离子水或盐水，使用接种环或棉签涂抹琼脂上菌落呈融合生长的区域，然后用微型研磨小杵在离心管里研磨菌块；或者也可在一支合适的试管中放入7-10颗直径为3mm的玻璃珠，与菌块一起使用旋涡振荡器大力振荡使菌块打散，制备菌悬液。
(2)然后将上述(1)中制备的菌悬液垂直静置15分钟，使其中剩余的较大菌块在重力作用下沉降到管底。
(3)用巴氏吸管吸取(2)中中部较浓菌悬液，小心的试探性的少量滴加几滴此浓菌悬液到盛有2ml去离子水或盐水的比浊管中，不断加入此浓菌悬液以调整到0.5麦氏浊度。如果你使用的比浊仪有一系列读数对应0.5麦氏浊度时，那么对于诺卡菌的菌悬液则应取其范围的中间值，这样的处理策略可以使这些易形成团块的微生物达到药敏试验所要求的接种物浓度（0.5M）。
注意：也可以使用液体培养基中的培养物制备0.5M菌悬液，可以像步骤(1)中使用玻璃珠涡旋振荡打散大块培养物，然后将液体培养基静置15分钟，将剩余较大细菌团块沉降到管底。
六、药敏试验的操作方法
最终接种物的制备取决于所用药敏板的种类：
1、包被好冻干抗菌药物的药敏板（未添加肉汤）
(1)添加50ul的0.5M菌悬液到10mlCAMHB肉汤中。
(2)颠倒混匀试管8-10次或涡旋充分混匀。
(3)板条中每孔加入ul第(2)步中制备的菌悬液.
(4)接种物作纯度检查：滴加1滴第(2)步中制备的菌悬液在血琼脂平板或胰酪胨大豆琼脂平板上并分区划线得到单个生长菌落。
2、已预先加入肉汤的药敏板（冷冻板）
(1)加1ml0.5M菌悬液到29ml无菌水中。
(2)颠倒混匀试管8-10次或涡旋充分混匀。
(3)倾倒所有菌悬液到无菌加样槽中。
(4)使用多道加样枪，药敏板每个孔中加入10ul菌悬液。
(5)接种物作纯度检查：滴加1滴第（2）步中制备的菌悬液在血琼脂平板或胰酪胨大豆琼脂平板上并分区划线得到单个生长菌落。
3、纸片扩散法确认磺胺药物的结果
(1)使用0.5M菌悬液，参照CLSIM02中操作步骤执行纸片扩散法。
(2)使用含有ug的磺胺甲基异恶唑纸片代表磺胺药物。
(3)35±2℃、非二氧化碳培养箱孵育72小时。
理论上，接种的最终菌悬液浓度应该大约在1.0×～5.0×CFU/ml（1.0×～5.0×CFU/每孔）。对于诺卡菌属来说，菌液要想达到接种浓度相对较困难，尤其当分离株形成致密团块时。如果接种物能够熟练而精心去制备，则菌落计数平板无需常规接种；相反，MIC的解释还应包括评估生长对照孔中细菌生长的情况，当生长不足或过足时可能得到的结果会与预期不符。在实施磺胺甲基异恶唑纸片扩散试验中经过适当的孵育后，可以评价诺卡菌的生长情况来指示接种物浓度是否适宜：生长不应融合，划线的痕迹是明显的，划线间的区域是清晰而明显的。
七、试验结果的观察和判读
用密封膜密封已接种的塑料药敏板，并将药敏板放入塑料袋中防止其干燥，药敏板可以摞在一起放入非二氧化碳培养箱，但不要超过三块。35±2℃孵育72小时后检查药敏板。需注意的是，红球菌24小时、某些冢村菌属菌种24～48小时，但是某些菌种，例如新诺卡菌（N.nova）则需要长达5天的孵育。
如果生长对照孔中生长（表现为浑浊或孔底出现沉淀）是充足的（例如：至少2+以上，如图1所示），记录MIC值；否则，应继续孵育药敏板，此后每天阅板（最多阅5天），直到生长充足。
所推荐的药物（除磺胺以外）MIC值都是其可以抑制可见生长的最低药物浓度，唯一例外的是甲氧苄啶/磺胺甲基异恶唑，它的MIC值难以准确测量；一般建议，它的MIC值是与生长对照孔相比较其生长被抑制80%的孔所对应的浓度；如果它的最低药物浓度孔显示出比生长对照孔长势还要好时，则应该用该孔相比较来判定生长被抑制80%的孔（见图1）。一个更实用的方法可能是将MIC解释为与生长对照孔相比较或与相邻较高抗生素浓度孔相比较，其生长量具有显著不同时的稀释度。
如果有疑义，应该用磺胺甲基异恶唑纸片进行扩散法与微量肉汤稀释法得到的药敏结果进行比较，抑菌环直径≥35mm表示敏感，≤15mm表示耐药，16～34mm时表示缺乏足够数据而无法解释。当稀释法和扩散法结果不一致时，应该重复试验或将分离株送参比实验室。当报告诺卡菌磺胺耐药时应谨慎，因为大多数的菌株对磺胺是敏感的。
图1.诺卡菌的药敏生长及终点判定的实例
孔的右侧显示抗生素的浓度和生长量估计值，箭头处表示MIC。
缩写：POS：生长对照；NEG：阴性对照；4+:生长非常充分；3+：生长充分或浑浊；2+：中度生长或浑浊；1+：浑浊、轻度浑浊、中等数量的菌落；+/-：少数可数的菌落或轻微的浑浊。
A、环丙沙星、MIC=4ug/ml
B、妥布霉素、MIC=32ug/m
C、甲氧苄啶/磺胺甲基异恶唑、MIC=2/38ug/ml(MIC在大约80%抑制处)
D、阿莫西林/克拉维酸、MIC=16/8ug/ml
E、莫西沙星、MIC=4ug/ml
八、结果解释和报告
诺卡菌属，如表1所示，对于每种测试药物均应报告MIC及解释结果（即S、I、R）。
马红球菌应按照CLSIM中金黄色葡萄球菌的折点来执行。这些折点只是暂时性的，有待于更多数据的积累。
对于其他的需氧放线菌（除了马红球菌）其解释均依据MIC值并参考下表中注解“a”。
表1、需氧放线菌的药敏解释标准
表注：
a、本表中的折点适用于诺卡菌属，也可暂时用于其他需氧放线菌。其他需氧放线菌使用这些折点是基于微生物种群分类、临床数据、其他微生物使用的折点、本领域专家的经验。这些折点只是暂时性的，应该等待进一步的数据积累。
b、对于马红球菌可以使用CLSIM文件中关于金黄色葡萄球菌的解释标准，其中要包括万古霉素和利福平的结果。但这个解释分类，应该从暂时性的数据积累进行考虑和报告，以获得进一步的信息。
c、以下抗生素折点与CLSIM中需氧生长的微生物的当前建议不同：阿米卡星、米诺环素、莫西沙星。
d、环丙沙星和左氧氟沙星是可以互相替代的。两者在体外活性较新型的8-甲氧基氟喹诺酮类药物差。
e、新型大环内酯类药物的代表
f、诺卡菌的分离株中没有利奈唑胺MIC8ug/ml的报告。
九、常见诺卡菌的药敏模式
对于诺卡菌属，在报告MIC及解释结果（即S、I、R），应注意应与被测菌种的预期药敏结果进行比较（见表2），如果MIC评价的解释结果与该菌种的药物耐药性预期值相比不同，则应重复试验或将其送到对需氧放线菌的药敏试验有丰富经验的参比实验室去进行确认。
表2、常见的诺卡菌预期药敏模式
表注：
a、菌名对照：圣乔治诺卡菌（N.cyriacigeorgica）、脓肿诺卡菌（N.abscessus）、新诺卡菌复合群（N.nova
