1引言(Introduction)
石油污染对生态环境造成的危害日益严重,采用物理或化学手段可有效降低石油污染,但存在二次污染及治理成本高、条件苛刻等缺点,生物降解法具有条件温和、环境影响小、适应性广等优点,是治理石油污染有效方法之一.已报道能降解石油的微生物包括细菌、放线菌、霉菌、酵母及藻类.其中以细菌种类最多,主要有假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、棒状杆菌属(Corynebacterium).不同环境来源微生物特性差别较大,对石油组分降解能力及降解途径不同,我国大部分油田开采及运输区冬季冰期较长、平均气温低,微生物处理效果受温度等条件影响大,寻找耐高盐、酸碱等极端环境微生物具有重要意义.
本文从我国西部石油污染土壤中筛选了一株适应性强、降解能力高的石油降解菌株,进行了生理生化及16SrDNA序列分析,并对菌株生长及降解特性进行研究.将该菌添加到活性污泥中,采用SBR间歇式活性污泥法处理含油废水效果良好，为极端环境下微生物治理石油污染及含油废水处理提供科学依据.
2材料与方法(Materialsandmethods)2.1样品及培养基
污染土样取自于甘肃金川公司周边石油污染土壤,原油样品来自于中石油兰州石化公司.
LB培养基：蛋白胨5.0g;酵母粉2.5g;NaCl5.0g;琼脂10.0g;pH7.0;蒸馏水mL.
基础培养基：NH4NO33.0g;K2HPO41.5g;KH2PO41.5g;NaCl0.5g;MgSO4·7H2O0.1g;FeCl20.01g;CaCl20.01g;pH7.0;蒸馏水mL.
2.2试剂及仪器
TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAMaker、细菌基因组DNA提取试剂盒(均来自上海生工生物工程股份有限公司),Agarose(TaKaRaBiotechnology),十七碳酸甲酯(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司),石油醚(天津市富宇精细化工有限公司).
TRACEDSQGC-MS联用仪(美国赛默飞世尔科技有限公司),UV-PC紫外可见分光光度仪(尤尼柯上海仪器有限公司),Tanon-3凝胶图像处理系统、EPS-电泳仪(上海天能科技有限公司),TC-96/G/HPCR扩增仪(杭州博日科技有限公司),5B-3B(V8)水质测定仪(兰州连华环保科技有限公司).
2.3石油降解菌的筛选及鉴定
取10g石油污染土样加入mL无菌水中,于30℃、r·min-1振荡培养24h.取上层液体2mL,加入到mL以原油为唯一碳源的基础培养基驯化培养,原油浓度逐级递增为,,0,mg·L-1,每次驯化周期为3d.取末次驯化培养液,以10-1、10-3、10-5倍稀释,在LB培养基上涂板,分离优势菌,于-80℃保藏备用.已分离菌株再转接到原油浓度为0mg·L-1的基础培养基中,于30℃、r·min-1培养7d,测定石油降解率,最后选取1株适应能力强、高效利用石油菌株JC-.细菌形态观察、革兰氏染色、生理生化鉴定参照文献进行.
用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取细菌总DNA,采用16SrDNA通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGCTCAG-3′;R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增目的片段,反应循环参数如下：94℃预变性5min,94℃变性50s,58℃退火1min,72℃延伸2min,30个循环,72℃延伸10min.PCR产物送上海生工生物工程公司测序,在NCBI基因库中进行BLAST比对,通过CLASTALX和MEGA4.0软件构建系统发育树.
2.4石油降解菌生长特性
菌株JC-按1%接种量(V/V)接入LB液体培养基,分别于5、15、25、30、35、40、45、55℃,r·min-1振荡培养24h,测定各培养液ODnm,确定菌株的最适生长温度.选择初始pH分别为2、4、6、7、8、10、12,盐度分别为0%、1%、2%、3%、4%、5%,于35℃、r·min-1条件下培养24h,测定各培养液的ODnm,确定菌株的最适生长pH和盐度.
取JC-菌液2mL转接到原油浓度为0mg·L-1基础培养基,分别在15、35℃条件下振荡培养,在1、3、5、7、10、15、20d对进行取样涂平板计数,计算菌株在原油培养基中生长数量.
2.5石油降解率测定
将菌株JC-接种于含0mg·L-1原油基础培养基中,分别于15、35℃,r·min-1振荡培养15d,试验设3组平行、3组空白.重量法测定石油降解率,即以石油醚为萃取溶剂,对残余原油进行反复萃取回收,萃取液用干燥无水硫酸钠过滤到烧杯中,自然干燥并称重.石油降解率(η)按(1)式计算：
(1)
式中,M1为对照组石油质量(g),M2为样品组石油质量(g).
用正己烷萃取培养液中剩余原油,过滤掉残余菌体和杂质,定容到mL容量瓶中.以十七烷碳酸甲酯作为内标物(IS),用GC-MS对石油烷烃组分进行分析,用内标法测定残余石油中烷烃组分含量.GC-MS运行条件：DB-5MS毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm;采用程序升温,柱温50℃,维持3min后以15℃·min-1的速率升到℃,再以8℃·min-1升温速率升到℃,保持25min.载气氦气,柱流量1mL·min-1,分流比20:1.进样口温度℃,传输线温度℃,进样量1μL,离子源温度℃,EI源,电离电压70eV;扫描范围35~amu.
2.6菌株在不同有机碳源中生长特性
将菌株JC-接到不同浓度十二烷、二十四烷、正庚烷、正辛烷、正癸烷、环己烷、苯、甲苯、二甲苯、联苯、邻苯二酚、芘、萘、蒽、菲为唯一碳源的基础培养基,于35℃、r·min-1培养7d,取样计数,计算菌株在不同有机碳源中生长数量.
2.7石油降解菌对含油废水的处理
从兰州市某污水处理厂生物曝气池取一定量活性污泥对其进行5d驯化培养,按泥水比为1:3的比例,取活性污泥2.3L、水6.9L加入圆柱形生物反应器中(h=80cm、d内=14cm、σ=0.5cm、V有效=12.3L).以葡萄糖(mg·L-1)、氯化铵(mg·L-1)、磷酸二氢钾(7mg·L-1)为进水营养物质,进水各指标浓度为COD：.9mg·L-1;NH4+-N：48.74mg·L-1;TP：1.mg·L-1;原油：mg·L-1.室温为26~34℃,1d运行两个周期,曝气10h,停留2h,在装置停止运行期间加营养换水.以2%(V/V)接种量接JC-菌液于反应器中作为实验组,以不加JC-菌液反应器为空白对照组.分别于1、3、5、7、10、12、15d取样,测定出水COD、NH4+-N、TP、原油浓度,计算各指标去除率.实验组反应器中JC-菌株进行分离、鉴定,计算JC-在反应器中数量.
3结果(Results)3.1石油降解菌筛选和鉴定
从西部石油污染土壤分离到具有高效石油降解能力的优势菌株JC-,菌落呈桔红色,圆形不透明,表面光滑,边缘规整,细胞为球杆状,细菌16SrDNA与赤红球菌(Rhodococcusrubber,NR_.1)序列相似性为%,菌株在GenBank中序列登录号为KT,在系统发育树上与其聚类(图1),初步确定JC-为赤红球菌(Rhodococcusrubber).
表1菌株JC-生理生化特征
图1菌株JC-的系统发育树
3.2菌株JC-生长特性
把JC-接种于LB液体培养基,分别在不同温度、初始pH和盐度下培养.发现其在15～40℃、pH6～8、盐度0～4%的条件下生长良好,菌株最适生长温度为35℃,最适pH8,最适盐度为1%(图2A、B、C).JC-在原油为唯一碳源的培养基生长情况如图2d所示,15℃培养时,JC-在最初1～3d生长缓慢,3d后菌体数量明显增长,15d时达最高.在35℃培养时,在1d数量明显增加,5d达最高,7d后菌体数量开始下降.
图2菌株JC-生长特性(a.温度对菌株生长影响;b.初始pH对菌株生长影响;c.盐度对菌株生长影响;d.菌株在含原油培养基中生长特征)
3.3JC-对原油降解能力及对烷烃组分利用
JC-接种于原油浓度为0mg·L-1基础培养基,分别于15和35℃培养15d,对原油降解率分别为58.18%和41.61%.GC-MS分析发现原油中以直链烷烃为主,包括正十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十九烷、二十烷、二十一烷、二十四烷、二十七烷、二十八烷、四十四烷.在35℃培养时,对直链烷烃、植烷、姥鲛烷的降解率分别为98.16%、54.60%和85.46%,15℃培养时的降解率分别为96.13%、48.61%和86.83%(图3).
图3菌株JC-降解原油的GC-MS分析(a.RT=13.39为正十五烷,RT=16.18为正十七烷,RT=20.36为十七烷碳酸甲酯(内标物),RT=21.22为正二十一烷;b.RT=16.20为姥鲛烷,RT=17.59为植烷,RT=20.36为十七烷碳酸甲酯,RT=23.46为正二十七烷;c.RT=13.43为正十五烷,RT=16.23为正十七烷,RT=20.41为十七烷碳酸甲酯,RT=21.27为二十一烷;d.RT=12.85为植烷,RT=15.48为正二十烷,RT=16.25为姥鲛烷,RT=20.41为十七烷碳酸甲酯)
3.4菌株JC-对不同有机碳源的利用
将JC-接于不同有机物为唯一碳源基础培养基中,35℃培养7d,结果如表2所示,菌株在十二烷、二十四烷、正辛烷中生长较好,也能在邻苯二酚、萘、蒽等芳香烃的培养基中生长.
注:“-”菌落数小于对照组的2倍;“+”菌落数超过对照组2倍低于4倍;“++”菌落数高于对照组4倍低于10倍;“+++”菌落数高于对照组10倍低于20倍;“++++”：菌落数高于对照组20倍.
表2菌株JC-在不同有机碳源中生长情况
3.5菌株JC-对含油废水的处理
通过SBR间歇式活性污泥法,含油废水处理15d后,出水各指标浓度和去除率见图4,实验组COD、NH4+-N、TP的平均去除率分别为96.49%、96.88%、99.15%,石油去除率为92.43%,不加入石油降解菌的对照组去除率为53.80%.菌株JC-在SBR生物反应器中生长情况见图5,JC-在废水中的初始浓度为2.66×cfu·mL-1,在处理含油废水1~15d的时间内,JC-数量维持在4.8×～1.0×cfu·mL-1.
图4含油废水出水指标浓度和去除率
图5菌株JC-在含油废水中的生长情况
4讨论(Discussion)
已报道降解石油微生物超过多种,不同菌株对石油组分降解效果存在差异,Quatrini等从地中海海岸线石油污染土壤筛选出一株诺卡氏菌、两株红球菌和两株戈登氏菌,其中红球菌对C20和C28的降解率分别为54.39%和81.29%(Quatrinietal.,8).Walter等分离的红球菌可降解芘等多环芳烃.Soudi等从石油污染土壤分离的红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)SKO-1,培养56h后对浓度为mg·L-1苯酚的降解率为99.64%.Johnson等分离的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)只对C5~C10烷烃有很好降解效果.本文从我国西部石油污染土壤中分离的赤红球菌JC-在15℃培养15d后对原油的降解率为41.61%.GC-MS分析发现原油中96.13%正构烷烃(C14~C44)被降解,同时也能降解支链和复杂的植烷、姥鲛烷等.在正十二烷、正二十四烷、正辛烷及邻苯二酚、蒽、萘等有机物中较好生长,表明该菌能利用和分解这些化合物.
含油废水通常呈高COD、高油含量、高氨氮等特点,对其处理难度较大,利用高效石油降解菌处理含油废水具有广阔应用前景.徐新阳等从石油污染土壤和含油废水活性污泥中驯化了4株石油降解菌,对含油废水处理64h后,发现对含油废水中COD的去除率最高达68.00%,混合菌对含油废水中COD的去除率明显高于单一菌种(徐新阳等,7).罗群等以活性污泥为微生物菌种来源,构建了小试反应装置,利用添加柴油的海水驯化高效石油降解菌,发现柴油大部分组分得到了不同程度降解,两个平行反应器中柴油的降解率分别达到98.30%和98.80%(罗群等,).本文自主设计SBR活性污泥处理装置,采用间歇式活性污泥处理方法研究了添加JC-对高浓度含油废水处理效果,经15d处理后,出水水质中的COD、NH4+-N、TP的平均去除效率高,对废水中原油有显著降解效果.菌株在含油废水中稳定生长,一次添加即可维持所需菌量,且菌体数量一直维持在较高水平,表明该菌株能适应废水环境,又呈现出较好原油去除能力.
5结论(Conclusions)
1)从石油污染土壤中筛选出1株高效石油降解菌JC-,经细菌形态学、生理生化及16SrDNA序列分析初步鉴定为赤红球菌(Rhodococcusrubber),该菌具有较广环境适应性,在15～40℃、初始pH6～8、盐度0～4%条件下生长良好.
2)赤红球菌JC-在15和35℃下培养15d对原油的降解率分别为41.61%和58.18%,在35℃培养时,对直链烷烃、植烷、姥鲛烷的降解率分别为98.16%、54.60%和85.46%,15℃培养时的降解率分别为96.13%、48.61%和86.83%.能分解利用十二烷、二十四烷、正辛烷及邻苯二酚、蒽、萘等芳烃.
3)用SBR间歇式活性污泥法,将赤红球菌JC-用于含油废水处理,菌株在含油废水中生长良好,15d后处理废水出水的COD、NH4+-N、TP的平均去除率分别为96.49%、96.88%、99.15%,石油去除率为92.43%,可用于极端环境石油污染废水处理及污染土壤生物修复.
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