“道者，万物之奥，善人之宝，不善人之所保。美言可以市尊，美行可以加人，人之不善，何弃之有？故立天子，置三公，虽有拱璧以先驷马，不如坐进此道。古之贵此道者何？不曰：求此得，有罪以免邪？故为天下贵。”——《道德经》
空气中含有约80%的氮气，但植物、动物、人类和大多数微生物都不能直接利用这种气态氮作为氮素营养。自然界中只有极少一部分微生物可以将氮气逐步还原为氨而作为氮源。这种分子态氮的生物还原作用称为生物固氮作用。就世界范围来说，由生物固氮作用固定的氮素量要远比由工业固定的氮素量高。
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固氮微生物与固氮体系
生物固氮作用是固氮微生物的一种特殊生理功能。具有生物固氮能力的微生物生理类群称统为固氮微生物。共生固氮微生物指只有与高等植物或其他生物共生时才能固氮或有效固氮的微生物。自生固氮微生物指在土壤中或培养基上独立生活时而不与植物共生即能固氮的微生物。
根据固氮微生物是否与其他生物一起构成固氮体系，可分为自生固氮体系和共生固氮体系两大类型。依据固氮微生物与不同生物构成的共生固氮体系，可将它们分为豆科植物与根瘤菌共生固氮体系、联合共生固氮体系、蓝细菌与红萍共生固氮体系、蓝细菌与某些真菌形成地衣的共生固氮体系和非豆科木本植物与放线菌等的共生固氮体系。自生固氮体系又可分为光能自生固氮和化能自生固氮两种类型。
研究者们运用化学分析法、同位素N15标记法和乙炔还原法等，发现和肯定了自然界中许多微生物的固氮能力。至今已确定的固氮微生物（包括细菌、放线菌和蓝细菌）已近50个属。与固氮微生物可共生固氮的豆科植物约有个属，非豆科植物有13个属。而且已经证明尽管固氮微生物多种多样，但都是原核微生物，至今尚未发现任何自然的真核生物具有固氮能力。固氮微生物在好氧性、厌氧性和兼性厌氧性，化能营养型、光能营养型、异养型、自养型等各个微生物生理类群中都有广泛分布。
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自生固氮微生物
自生固氮微生物的种类很多，它们除了能固氮这一共同特性外，形态和生理特性各不相同。
好氧性化能异养型固氮微生物在自然界中最为普遍，其主要代表是固氮菌群。
固氮菌属（Azotobacter）细胞个体较大，幼年细胞为杆状，随着生长可变为球状，单个或成对，有时许多细胞不规则地聚集在一起。革兰氏染色负反应，多数能运动，有周生鞭毛，不形成芽孢，但能形成厚壁的孢囊。固氮菌可分泌大量黏液形成荚膜。能形成色素，有些种类产生非水溶性黄、棕、褐或黑色素，有些种可产生水溶性黄绿色荧光色素。
固氮菌的营养条件与一般腐生性细菌相似，可利用许多简单碳水化合物、醇和有机酸作为良好碳源。一般每消耗1g碳水化合物可固氮10mg。固氮菌除能利用分子态氮外，还能利用铵盐和硝酸盐等无机氮化物。在含有化合态氮的培养基中生长时不固定分子态氮。生长时还需要磷、钾、钙、硫、镁等矿质养分。各种微量元素尤其是钼对于固氮菌的生长和固氮都具有促进作用。固氮菌自身可合成必需的维生素类物质。但在培养基中加入吲哚乙酸、维生素B1和维生素C等时，可促进固氮菌的生长并提高固氮效率。
固氮菌为好氧性微生物，生长的氧化还原电位最适范围在Eh～mV之间。它们利用极高的呼吸率氧化有机物，对固氮酶进行防氧保护。固氮菌生长的适宜温度为25～30℃，高于45℃即会死亡。对湿度要求较高。对酸性环境很敏感，最适宜pH为7.0～7.5，生长范围为5.8～8.5。固氮菌能合成多种对植物生长有一定的刺激作用的维生素类物质，如生物素、环己六醇、烟碱酸、泛酸、吡醇素和硫胺素等。
其他的自生固氮菌有固氮单胞菌（Azomonas）、拜氏固氮菌（Beijerinckia）和德氏固氮菌（Derxia）等。另外还有节杆菌（Arthrobacter）和黄杆菌（Xanthobacter）等。
专性厌氧固氮微生物主要是一些发酵型的梭状芽孢杆菌（Clostridium），如最早分离的巴斯德梭菌（C.pasteurianum）。巴斯德梭菌是较大的杆菌，单生或成对，周生鞭毛。芽孢位于细胞中部或偏端，形成芽孢后细胞膨大呈梭状。最适生长温度为25～30℃，生长pH范围为5.0～8.5。此菌的固氮效率较固氮菌低，每消耗1g葡萄糖可固定1.5～7mg氮素。
专性厌氧的硫酸盐还原细菌群中，有些属的种具有固氮作用。如脱硫脱硫弧菌（Desulfovibriodesulfuricans）、普通脱硫弧菌（D.vulgaris）和巨大脱硫弧菌（D.gigas），瘤胃脱硫肠状菌（Desulfotomaculumruminis）和东方脱硫肠状菌（D.orientis）等。近年来，已证明严格厌氧的产甲烷细菌中有一些种如巴氏甲烷八叠球菌（Methanosacrinabarkeri）菌株等具有固氮活性。
兼性厌氧固氮微生物主要包括肠道杆菌科和芽孢杆菌科的一些属种，如欧文氏菌（Erwinia）、埃希氏菌（Escherichia）、克氏杆菌（Klebsiella）、柠檬酸细菌（Citrobacter）、肠杆菌（Enterobacter）、芽孢杆菌（Bacillus）等。芽孢杆菌中的多粘芽孢杆菌（B.polymyxa）、浸麻芽孢杆菌（B.macerans）和环状芽孢杆菌（B.circulans）都能进行兼厌氧性生长和固氮。
化能无机营养型类固氮微生物至今发现和证实的仅有一种，即硫杆菌属（Thiobacillus）中的氧化亚铁硫杆菌（Thio.ferroxidans）。这是一种能固氮的独特的营养类型。
光合型固氮微生物可以分为光合细菌和蓝细菌两大类群。光合细菌群广泛存在于海域和淡水环境，又可分为紫细菌、紫色非硫细菌和绿细菌等非产氧光合细菌。它们都是原核微生物的G－细菌，具有特征性的细菌叶绿素a，只含一个光系统，营不放氧光合作用。蓝细菌群即蓝绿藻中的许多属种能进行固氮作用，现已证明24个属的多个种具有固氮能力，其中大多属于念珠藻科，少数属于胶须藻科和蓝珠藻科。从形态上可分为有异形胞的蓝细菌和无异形胞的固氮丝状蓝细菌如鱼腥藻属（Anabaena）、念珠藻属（Nostoc）、柱孢藻属（Cylindrospormum）、单歧藻属（Tolypothrix），它们在自然界中有广泛分布。
固氮蓝细菌固氮量仅次于豆科植物与根瘤菌的共生固氮系统，且生理过程与放氧型光合作用相偶联，进化上有特殊地位，在固氮的同时也放氢，是一个有希望利用的太阳能生物转换系统。
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根瘤菌和豆科植物的共生固氮
根瘤菌和豆科植物的共生固氮作用是一种最具有实际经济意义的生物固氮类型。共生生物固氮机理、根瘤菌的形态生理、遗传进化、生态学和分子生物学等都得到了深入研究。
（1）根瘤菌的形态和生理特征
实验室条件下根瘤菌为（0.5～0.9）μm×（1.2～3.0）μm大小的杆菌，革兰氏染色阴性，与其他土壤杆菌相似。细胞单个或成对，常可见成群排列。幼龄时能运动，快生型根瘤菌具周生鞭毛，而慢生型根瘤菌具单生鞭毛。无芽孢。幼龄细胞染色均匀，但老龄菌体细胞由于积聚有不染色且折光性强的聚β‐羟基丁酸颗粒而导致染色不均匀或呈环节状。细胞外可形成大量黏液物质。
与豆科植物营共生时，根瘤菌形态经历不同变化。在从土壤进入根内时为很小的杆菌。随着根瘤发育，进入根瘤细胞内的菌体逐渐膨大或分叉，成为梨形，棒槌形，T形或Y形，这些特殊形态的根瘤菌称为类菌体。在类菌体形成之前，即可能开始固氮，在类菌体充分成熟阶段，即进行旺盛的固氮过程。快生型根瘤菌的大类菌体具有固氮功能而失去繁殖能力，而含菌组织中另一类正常的小杆菌仍保持有繁殖能力，从根瘤中分离培养的根瘤菌实际上是这种小杆菌的后代。
在糖类‐酵母膏平板培养基上的根瘤菌单菌落为圆形，直径0.1～0.5cm，边缘整齐，无色、白色或乳脂色，有光泽。在培养基上各种根瘤菌的生长速度不同，豌豆，三叶草和菜豆等快生型根瘤菌，接种2天后即可出现菌落，4～5天后已较大。而大豆、豇豆等慢生型根瘤菌，接种3～4天后才有生长，1周后菌落生长充分。
根瘤菌营化能异养型生活，利用有机物作为碳源和能源。快生型根瘤菌可利用的碳源很多，如葡萄糖、果糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖等多种糖类、多元醇和有机酸。但慢生型种类对于碳源的要求比较严格，仅利用少数糖类如葡萄糖、戊糖等。根瘤菌分解糖类不产气，有些种类可产生微量的酸。
根瘤菌可利用铵盐或硝酸盐为氮源，但仅有无机氮源时生长不良，氮素物质如酵母汁、豆芽汁等才生长良好。非共生条件下根瘤菌的氮源以化合态氮为主，分子态氮不能作为主要氮源。很多氨基酸可促进根瘤菌生长。根瘤菌生长需要各种矿质营养，尤其对磷的要求较高，其他如镁、钙、铁、钼、钴等元素也是必不可少的。根瘤菌生长还需要有丰富的B族维生素。
根瘤菌严格好氧，但对氧的要求不高。根瘤菌生长的Eh在～mV。大多数根瘤菌的最适生长温度在25～30℃之间。生长的适宜pH值在6.5～7.5之间。
根瘤菌一般对广谱性抗生素敏感。农业上广泛使用的杀虫剂、杀菌剂和除草剂对于根瘤菌的存活、结瘤和固氮效应的影响比较复杂，反应不一。
（2）根瘤菌与豆科植物的共生结构——根瘤根瘤形成过程可以分为根瘤菌感染、根瘤发生和根瘤发育三个阶段。豆科植物根系在土壤中发育，分泌类黄酮化合物，刺激相应的根瘤菌在其根际大量繁殖。根瘤菌通过对豆科植物特定的识别作用，吸附在根表。在根瘤菌的作用下，根毛细胞壁变软，发生卷曲，根瘤菌从变软的植物根尖细胞壁处进入根毛，逐渐形成一条明显的套状侵入线。根瘤菌在侵入线内不断繁殖，并使侵入线不断伸长。当侵入线推进到皮层的3～6层细胞时，处在前方靠近内皮层的细胞受到刺激，分裂成为根瘤的分生组织。随着分生组织的不断分裂，根瘤不断长大，不断长大的根瘤又分化为不同组织，同时形成维管束并与根的维管束相连，以保证营养物质的输送。根瘤菌在侵入线壁逐渐解体时释放到细胞中，先聚集在寄主细胞的细胞质外围，并开始迅速大量繁殖，充满细胞，形成含菌细胞组织。随后含菌细胞形成泡囊，每个泡囊初含一个细菌，随着细菌的几次分裂，每个泡囊中可含有8个细胞。此时的根瘤菌细胞形态变异为多形态的类菌体。此时一般不再分裂，类菌体充满寄主细胞。随着含菌细胞的形成，类菌体的泡膜里出现红色的豆血红蛋白。这是根瘤成熟的显著特征，标志着此时开始固氮。根瘤是豆科植物和根瘤菌共生形成的特殊形态，是根瘤菌固氮的场所。因此豆科植物和根瘤菌之间的共生固氮量与四个因子相关。①根瘤的数目；②每个根瘤中含菌组织的容积和类菌体数量；③含菌组织所持续的时间；④根瘤菌各个种的比固氮活性等。一个有效的根瘤应含有丰富的豆血红蛋白，能保证供给固氮所需的能量，能及时地同化和转运固氮产物，避免产物的反馈抑制。豆血红蛋白（leghaemoglobin，Lb）在根瘤中起着调节氧的缓冲剂作用，它向类菌体提供低浓度高流量的氧气，这样既保证固氮酶不因高氧压而失活，又能充分保证类菌体进行氧化磷酸化所需的氧气供给，使固氮酶呈现较高的固氮活性。豆血红蛋白的合成是由不同的基因编码的，其血红素部分是由根瘤菌携带的基因决定的，而蛋白质部分是由寄主豆科植物的基因编码的。两部分由各自的基因表达合成后再行装配为有效的豆血红蛋白。根瘤中根瘤菌的生存、代谢活动和固氮作用都需要有足够的能量供给。类菌体所需的能源物质由豆科植物的光合产物输送到根瘤的含菌组织，然后通过氧化磷酸化合成ATP。在豌豆植株中每同化单位的碳有32单位的碳被转运到根瘤中。氨是固氮作用的最初产物，它一形成就从类菌体中分泌出来，这些氨必须立即被同化并转运，否则会对固氮酶造成反馈抑制。同化氨的第一步是由谷氨酰胺合成酶作用合成谷氨酰胺：谷氨酰胺合成酶可在氨很低浓度时起作用，因而可有效地同化和转运氨。在有NAD（P）H2提供电子时，谷氨酰胺与α‐酮戊二酸反应成2个谷氨酸： α‐酮戊二酸＋谷氨酰胺＋NAD（P）H2→２谷氨酸＋NAD（P）＋在有高浓度氨并有NAD（P）H2提供电子时，可在谷氨酸脱氢酶（GDH）催化下，氨直接与α‐酮戊二酸反应生成谷氨酸：类菌体中每固定单位的氨，只保留6单位的氨在根瘤中，绝大部分（91单位）转运给植株地上部分，而极小部分（3单位）转运给根系。04
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其他微生物的共生固氮
除豆科植物与根瘤菌之间的共生固氮作用外，还有内生菌和非豆科植物、蓝细菌和植物、蓝细菌和真菌之间的共生固氮以及细菌和水稻、玉米等禾本科植物的联合固氮作用。
（1）内生菌和非豆科植物的共生固氮
已知双子叶植物中能形成根瘤的有13个属的个种，它们都是木本植物，如桤木（Alnus）、杨梅（Mgrica）、木麻黄（Casuarina）、马桑（Coricuria）和沙棘（Hippophae）等，其中54个种已被证明结的根瘤具有固氮作用。它们根瘤的形成和结构与豆科植物根瘤不一样。在刚开始时，在根上出现小的突起，一两周后许多小突起簇生在一起，形成可达几厘米的根瘤簇，并可在根瘤簇的小球上又长出根来。根瘤内部结构与根的结构相类似，内生菌生存于皮层细胞中。
非豆科木本植物根瘤的共生菌是Frankia属放线菌。在形态上为纤细稀疏的菌丝体，菌丝分枝具横隔，发育后在菌丝顶端或菌丝间形成孢子囊。孢子囊为菌丝多向分裂形成的孢子堆构成，形态多样，大小不一。孢子囊内含有圆形或带角状、无鞭毛、不运动的孢子。Frankia放线菌能形成具有固氮功能的顶囊（vesicle），顶囊着生于顶囊柄上，再与菌丝相连。Frankia放线菌为微好气菌，有些种可产生黄、棕、褐等各种水溶性色素。利用Frankia放线菌接种试验表明，结瘤植物明显要比对照植株生长好，含氮量也高。
（2）蓝细菌和植物的共生固氮
红萍是热带和亚热带地区分布非常广泛、生长迅速、极为繁茂的水面蕨类植物。红萍是蓝细菌和蕨类植物的共生体。能固氮的红萍鱼腥藻（Anabaenaazolla）生活于小叶鳞片腹部充满黏质的腹腔中。红萍提供光合作用产物作红萍鱼腥藻生活和固氮的碳源和能源，而红萍鱼腥藻则提供固氮产物。这种共生体的固氮效率很高，而且红萍含有很高量的易降解有机物，在我国南方是稻田中一种很有价值的水田绿肥。
蓝细菌念珠藻（Nostoc）或鱼腥藻（Anabaena）可以与裸子植物苏铁共生，使根形成反复二歧分枝形或珊瑚状，与正常根系完全不一样。用N15可证明这种珊瑚状根具有固氮作用。
在根乃拉草属（Gunnera）的植物叶片基部腺体中发现有念珠藻生存，并已用N15和乙炔还原法证明这些腺体中的念珠藻具有固氮活性。
（3）蓝细菌和真菌的共生
地衣是蓝细菌和真菌的共生体，在自然界中广泛分布于岩石、树皮、土壤，对于土壤的形成具有重要作用。在地衣中常见念珠藻、眉藻等，并已用N15和乙炔还原法证明具有固氮作用。固定的氮素可提供给真菌。
（4）联合固氮作用
联合固氮作用是指某些固氮微生物在植物根系中生活，并具有比在土壤中单独生活时高得多的固氮能力，但这种在植物根系中的生活方式又不同于根瘤菌和豆科植物根系之间的共生，两者既不形成共生体又较“松散”。在点状雀稗（Paspalumnotaton）根的黏质鞘套内生存有一种固氮菌，定名为雀稗固氮菌（Azotobacterpaspali），后又发现在热带牧草俯仰马唐（Digitariadecumbens）根系生活有固氮作用很强的含脂固氮螺菌（Azospirillumlipoferum）。随后在甘蔗、玉米、水稻等作物根际都测定到联合固氮活性。常见的联合固氮细菌有拜叶林克氏菌属（Beijerinckia）、雀稗固氮菌、固氮螺菌、粪产碱菌（Alcaligenesfaecalis）、假单胞菌（Pseudomonas）和阴沟肠杆菌（Enterobactercloa‐cae）等。它们生活在根表的黏液区内，甚至进入根内细胞。预览时标签不可点
