原创施毅赵佳宾医学界呼吸频道收录于合集#第六届东方呼吸病学术会议8个
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三分钟读懂宏基因组学二代测序在真菌病诊断的方方面面
以往，我们经常把细菌感染称为永恒的三角（图1），实际上，真菌感染是比细菌感染更难对付的永恒三角。近年来，世界卫生组织（WHO）也一直在探讨如何更加有效地遏制抗微生物药物耐药的问题。
年10月8日-10日，由上海市医学会、上海市医学会呼吸病学专科分会主办的第六届东方呼吸病学术会议在上海拉开序幕。会上，来自南京大医院呼吸与危重症医学科施毅教授为我们分享了宏基因组学二代测序技术（ｍNGS）在呼吸道真菌感染病原学诊断中的价值，一起来学习吧~
图1：永恒的三角
分子生物学在真菌病诊断中的地位与现状
欧洲指南既往的定义仅采纳了GM和G试验检测，并未采纳真菌核酸检验作为真菌感染诊断的生物标志物。近年来，临床循证医学的证据不断增加，才逐渐将聚合酶链式反应（PCR）用于感染性疾病微生物学的诊断。
现有研究显示真菌DNA的PCR扩增技术联合DNA测序将有助于进一步早期鉴定真菌，并可鉴定至菌种[1]，还可以检测到多种新出现或罕见的真菌菌株[2]。DNA测序技术可用于明确真菌致病菌，有助于缩短真菌菌株识别时间、指导临床抗真菌治疗，明确侵袭性真菌病（IFD）的发病机制[3]。mNGS是一种有效的方法，可以准确、无偏移地鉴别福尔马林固定的石蜡包埋组织中的真菌。该技术可以潜在提高侵袭性真菌感染的诊断和准确性[4]。欧洲指南同样证实PCR检测和DNA测序在IFD确诊中的价值，新增加了“组织核酸”诊断方法及诊断标准作为确诊IFD的依据[5]。
侵袭性肺曲霉病（IPA）的临床诊断标准也作了更新，即血清和/或支气管肺泡灌洗液（BALF）、PCR2次阳性是侵袭性肺曲霉病的临床诊断指标[6]。PCR检测方法、引物设计、真菌细胞壁破壁和DNA提取方法均对检测结果具有一定影响[7]。
虽然分子生物学检测已经成为真菌感染病原学检测的重要方法，但尚不能作为病原学确诊依据，因此常规实验室检查依然十分重要。由于mNGS技术行真菌检测的敏感性高于传统方法，且具备检测真菌耐药基因优势，目前可作为真菌感染的辅助诊断指标。
如何正确认识mNGS在真菌病诊断中的意义
施毅教授提出临床实际工作中，大家是否对mNGS的结果存在很多困惑？是否认为mNGS只要检测到真菌就是致病微生物？没有检测到真菌是否可以排除真菌感染？什么样的标本检测到的真菌最可靠？或最不可靠？检测到的真菌序列数越多是否致病菌的可能性就越大呢？根据mNGS结果何时可以启动抗真菌治疗呢？如果存在以上疑问，施毅教授带你逐一击破。
▎重点1：mNGS用于真菌检测的优势
首先，mNGS技术节省时间，不需要培养。相较于传统方法（如G/GM试验），可以精确区分真菌至种，甚至亚种。其次，在某些类型真菌的检测中，敏感性要高于传统方法，如曲霉；同时也无需假设，可以覆盖罕见真菌和其他类型病原体。最后，可通过核酸序列进行物种鉴定，特异性高，还可检测真菌的耐药基因。
▎重点2：mNGS用于真菌检测的劣势
第一，对采样要求较高，需要有效采集真菌感染的病灶部位，在深部真菌感染中可能存在困难。
第二，真菌细胞壁厚（如曲霉），或有坚固荚膜（如隐球菌），破壁困难，核酸不易释放，可造成假阴性。
第三，实验流程（如建库）容易引入环境真菌或试剂中真菌核酸的污染，比如灰绿曲霉，造成假阳性。
第四，真菌基因数据库不全，很多真菌缺乏全基因组数据（识别不出），且在公开的数据库中真菌序列经常存在人源序列的污染（识别错误）。
▎重点3：mNGS用于真菌感染时的注意事项
1）标本的采集，呼吸道感染时恰当的标本采集优选BALF，是反应呼吸道感染最常用以及较为可靠的标本。其次，可备选胸腔积液、血液、肺穿刺组织，虽然敏感性低，但结果可靠。也可备选痰液、气道吸引分泌物，但要注意容易受到上呼吸道菌群污染。
2）不同类型标本检出不同微生物的临床意义。
3）技术上的改进应解决真菌细胞壁厚，提取核酸困难的问题，要掌握适当与可靠的破壁技术。也要解决去人源技术的改进问题，避免检测到的都是人源序列，未检测到病原序列。最后还要完善不充分的真菌数据库。
4）必要时要查看原始数据，当检测报告无阳性结果时，患者又真的很像感染，就要想到是否真的为阴性？追查原始数据，及时发现真凶。
▎重点4：呼吸系统感染mNGS检测结果解读
1）根据最新共识[8]，需密切结合患者的发病过程、实验室检查、影像学等结果，判断检出病原体是否符合临床诊断并进一步通过其他技术进行交叉验证。
?若痰标本或BALF检出不存在或很少存在于口腔的病原体，如嗜肺军团菌、衣原体、百日咳博德特氏菌、白喉棒状杆菌等，考虑致病微生物可能大。
常见呼吸道确定的致病病原体如MTB、肺炎支原体、沙眼衣原体、肺炎衣原体、百日咳博德特氏菌、军团菌属、耶氏肺孢子菌、诺卡菌属、组织胞浆菌、球孢子菌属、隐球菌属、皮炎芽生菌及病毒等，此类病原体一旦检出即使序列数少仍需考虑致病微生物可能大。
另有一些少见的呼吸道确定病原体如土拉弗朗西斯菌、鼠疫耶尔森菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、贝纳柯克斯体、鹦鹉衣原体、布鲁菌、沙门氏菌属、多杀巴斯德菌、水痘带状疱疹病毒、寄生虫。但仍需注意某些环境和水源性微生物污染的可能，判读需谨慎。
?若呼吸道标本检出隐球菌属、曲霉属、毛霉属及其他丝状真菌的序列数较低，需结合影像学、血清学、组织病理学等考虑其为致病微生物的可能。
真菌（主要包括曲霉属、毛霉属、隐球菌属与双相真菌等）通常基因组较大，并且存在较厚的细胞壁，同样存在核酸提取效率低的情况。即使前期进行了破壁处理，其检出的特异序列数相对其他微生物仍然较少。
因此对于真菌的鉴定，有研究认为，ｍNGS检出真菌（种水平）的特异性序列数是任何其余真菌的５倍以上，判断为阳性。
由于不同检验机构ｍＮＧＳ流程、方法存在差异，检出结果有一定误差。对于上述检出较为困难的微生物，除了结合临床证据，建议和其他微生物检出技术交叉验证，如特异引物的PCR等分子生物学检测、ＧＭ试验等血清学试验等，进一步确认或排除病原微生物。
如果临床有疑似难检出的病原体感染，在报告中未列举，建议追溯原始数据进行复核，在报告阈值之外考虑可能的原始检出病原体。
?免疫功能抑制患者的呼吸系统感染检出的低毒力病原体，需考虑致病微生物可能大。
呼吸道定植病原体在免疫低下或呼吸道屏障功能破坏时，可能会由定植转为致病，如金黄色葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、念珠菌属或部分病毒等。
深部痰标本或BALF检出以上病原体，也需要重点
