基于NRPSs基因筛选与鉴定海芦笋内生细菌
李代婧，殷跃，刘梦婕，卫婷，郭佳，辛志宏
南京农业大学食品科技学院
盐生海芦笋(SalicorniabigeloviiTorr)，是通常生长在含盐率高的湖泊及土壤附近[1]的绿色蔬菜，味道鲜美，质脆多汁。海芦笋有茎无叶，不生虫子，提示其组织内部或表面可能含有能产生抗菌活性物质的内生菌或附生菌[2]。目前，有关海芦笋的研究大多集中在对其化学成分的分离鉴定及其生物活性研究方面，有关海芦笋内生细菌的研究鲜有报道。
传统的植物内生细菌的筛选方法多是采用活性筛选、化学筛选或二者的组合[3]，这些方法过去在筛选可以产生活性次级代谢产物的菌株研究过程中非常有效，但在研究不断深入的情况下，传统方法的弊端也日益明显：重复地发现已知的菌株和化合物，使得新菌株、新化合物的发现受阻，造成了时间和资源的极大浪费[4-5]。
近年来，随着测序技术和生物信息学的快速发展，许多微生物的生物合成机制逐步解密，新的植物内生菌筛选方法应运而生。非核糖体肽类化合物合成酶(nonribosomalpeptidesynthetase，NRPS)是生物合成次级代谢产物过程中的多功能关键酶，由催化氨基酸之间肽键形成的缩合(condensation,C)结构域、负责底物识别和活化的腺苷酰化(adenylation,A)结构域、硫醇(thiolation,T)结构域以及C末端终止延伸反应的硫酯酶(thioesterase,TE)结构域组成[6]。其中A结构域有很强的保守性，可以通过PCR扩增该区域基因，并通过系统发育分析预测化合物的结构类型。因此，以NRPS功能基因为靶点，定向筛选含有环肽化合物的菌株，成为从“基因-合成酶系-环肽”的筛选新方法。
本实验用采自新疆盐湖的野生海芦笋，采用平板划线法分离纯化培养得到内生细菌，提取其DNA，经PCR扩增16SrRNA目标序列后，建立系统发育进化树。通过观察菌落形态，并对菌株进行系统发育学分析，明确其种属地位。在此基础上，以NRPS(nonribosomalpeptidesynthetase)功能基因为指标，定向筛选含有NRPS基因的内生细菌，筛选到的菌株经发酵，ESI-MS(electrospraymass)分析发酵产物证实预测结果，以期为定向筛选能够产生环肽化合物的菌株提供新的思路。
1材料与方法1.1实验器材
盐生海芦笋，取自新疆盐湖。
Microfuge22R台式微量冷冻离心机，美国Beckman公司；TP型梯度PCR仪，日本TaKaRa公司；DYCP-31DN电泳仪，北京市六一仪器厂；JS-C全自动数码凝胶成像分析仪，上海培清科技有限公司。
D-01E.Z.N.A细菌DNA微量提取试剂盒，美国Omega公司；Cat#DP多功能DNA纯化回收试剂盒(进口离心柱型)，南京华普生物科技有限公司。
本实验主要采用如下培养基对细菌进行初步的分离培养：
细菌用培养基：牛肉膏蛋白胨培养基(1L)：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、去离子水mL、琼脂18g，pH7.2～7.4。
放线菌用培养基：高氏一号培养基(1L)。可溶性淀粉20g、KNO31.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、去离子水mL、琼脂18g。
真菌用培养基：孟加拉红培养基(1L)：葡萄糖10.0g、1/孟加拉红水溶液mL、蛋白胨5.0g、KH2PO41.0g、琼脂20g、MgSO4·7H2O0.5g、去离子水mL，氯霉素0.1g。
1.2实验步骤
1.2.1内生细菌的分离纯化
无菌条件下，先后将海芦笋浸在75%酒精、质量分数为1%的NaClO溶液、75%酒精中浸泡1min，然后用无菌水清洗3次，用灭菌后的吸水纸除去表面的水分。用灭菌后的剪刀将其剪成7～9mm小段，分别放在上述3种培养基上，每板3～5段，其中牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基于37℃恒温培养2d至茎末端长出菌落，孟加拉红培养基于30℃恒温培养5d直到茎末端长出菌落。用划线分离的方法纯化培养得到单菌落。
1.2.2形态学观察
将长有细菌菌落的平板，置于37℃培养2d，观察菌落的形态特征。
1.2.3细菌DNA的提取
按照生产厂家提供的试剂盒说明书进行。
1.2.SrRNA基因片段的PCR扩增
16S区域的扩增选择细菌16SrRNA的通用扩增引物16S(F)(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/16S(R)(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，45℃退火1min，72℃延伸1min40s，共35个循环，最后72℃延伸7min[7]。PCR扩增反应采用25μL的反应体系，包括ddH2O9.5μL、2×TaqMasterMix12.5μL、10μmol/LPrimer16S(F)1μL、10μmol/LPrimer16S(R)1μL、模板DNA1μL。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，4℃保存备用。
1.2.5NRPS基因片段的PCR扩增
NRPS基因片段的扩增选择的引物为NP1(5’-CCTAATTCAATACGAAAACCACGAADYTTNAYYTG-3’)/NP2(5’-TGTATGTTATTTATACTTCTGGTTCTACTGGTMRNCCANARGG-3’)，PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增反应采用25μL的反应体系，包括ddH2O9.5μL、2×TaqMasterMix12.5μL、10μmol/LPrimerNP11μL、10μmol/LPrimerNP21μL、模板DNA1μL。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，4℃保存备用。
1.2.6PCR产物的回收和克隆
按照生产厂家提供的试剂盒说明书进行。
1.2.7序列测定与系统发育学分析
将含有目的DNA序列的菌液交由上海美吉生物有限公司进行测序。获得序列后，通过Ezbiocloud(北京好的白癜风医院是哪家北京中科白殿疯病医院
