一、背景介绍
铁是DNA合成、新陈代谢和细胞增殖的基本元素。细胞铁摄取主要依赖于铁转运蛋白，如转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)和二价金属转运蛋白1(DMT1/SLC11A2)。过多的细胞铁是有毒的，铁的浓度必须严格控制。作为铁感受器，铁反应元件结合蛋白2(IREB2)参与铁转运蛋白的调节。IREB2直接与mRNA30-非翻译区(UTR)的RNA茎环结构结合，稳定TFRC或DMT1的转录本，从而增加细胞内的铁浓度。当铁过量时，泛素E3连接酶F-box/LRR-RepeatProtein5(FBXL5)促进IREB2的泛素化和降解，从而限制铁的吸收和利用。另一方面，当胞质铁不足时，IREB2的高水平表达是调节铁吸收所必需的。然而，在缺铁条件下维持IREB2稳定性的关键因素和调控机制仍不清楚。
铁是一种促氧化剂，可以与过氧化氢反应产生活性氧(ROS)。当抗氧化系统饱和时，过量的脂质ROS会引起细胞变化，最终导致铁死亡。尽管铁与铁死亡相关的机制尚不清楚，但TFRC或DMT1对铁死亡的刺激作用已经确定。细胞坏死和铁死亡与免疫性细胞死亡(ICD)相关。由于特定的危险相关模式分子(DAMP)的释放，ICD在癌症或传染病的背景下会触发宿主获得性免疫。然而肿瘤细胞已经发展出一系列策略来抑制DAMP释放，从而逃避免疫检测。尽管铁死亡与T细胞介导的细胞毒性作用有关，但铁死亡是否能引起ICD并增强宿主抗肿瘤免疫仍不清楚。
在本研究中，作者发现OTUD1作为IREB2的去泛素酶并阻止其降解，从而促进TFRC的表达，增加细胞的铁摄取。OTUD1主要在肠上皮细胞表达，在肿瘤发生过程中选择性下调。临床分析表明，OTUD1降低与结直肠癌预后不良密切相关。OTUD1-IREB2-TFRC通路的激活增加了细胞内的铁浓度，增强了细胞对铁死亡的敏感性，进而导致免疫原性细胞死亡，增强了宿主的抗肿瘤免疫能力。实验数据表明，肿瘤抑制因子OTUD1促进了铁的吸收，增强了宿主的抗肿瘤免疫能力。
二、结果解读
1、结肠癌发生过程中细胞铁摄取受损
尽管铁是多种生物过程中必不可少的元素，但铁代谢是否参与结直肠癌的发生仍是个未知数。为此，作者分析了来自大肠癌患者的数据集(GDS)，发现随着离子稳态的失调，与铁运输相关的基因在肿瘤中相对于正常组织减少，如LTF、CP、FTH1和TFRC(图1A)。接下来，作者从TCGA数据库中查询了结肠癌组织中的基因表达数据，发现铁代谢紊乱与大肠癌患者的不良预后高度相关(图1B)。为了进一步证实这些结果，作者测量了结直肠癌患者转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)的状态，与其匹配的正常组织相比，癌组织中TFRC的表达显著下调。此外，细胞内的铁传感器IREB2在结肠癌发生过程中也被下调(图1C)。值得注意的是，在结肠癌中，IREB2的蛋白水平降低，而不是它的mRNA水平降低。这些结果表明，在结肠肿瘤的发生过程中，铁的转运受到了损害。
2、OTUD1是IREB2的去泛素酶
在结肠癌中，IREB2的蛋白水平降低，但mRNA水平未降低，提示IREB2在结肠中的表达可能与翻译后修饰有关。为了验证泛素-蛋白酶体系统是否参与这一过程，作者使用抗IREB2抗体从原发性结肠癌和正常组织中拉下内源性IREB2。如图1D所示，与其匹配的正常组织相比，结肠癌组织中IREB2的泛素化程度增加。为了研究IREB2泛素化在结肠中的调控机制，作者用免疫沉淀和质谱(MS)鉴定了一系列IREB2相互作用蛋白，选出去泛素酶OTUD1——认为其可能参与IREB2泛素化和稳定性的调节(图1E)。通过对人类结肠中单细胞转录数据分析、免疫共沉淀和共聚焦实验，作者发现OTUD1仅在肠上皮细胞和杯状细胞中表达，并揭示了OTUD1的N端是与IREB2结合所必需的。值得注意的是，与含铁卟啉氯化血红素相比，补充铁螯合去铁胺(DFO)加强了IREB2与OTUD1的联系。
为了确定OTUD1是否能去泛素化IREB2，作者将野生型(WT)与其突变体(CS)OTUD1与IREB2共转染HEKT细胞。野生型OTUD1的异位表达降低了IREB2的泛素化，证实了OTUD1直接去泛素化IREB2。此外，作者发现OTUD1能有效去除Lys48和Lys63连接的IREB2的多泛素化。作者用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理细胞，发现在缺失OTUD1的细胞中，IREB2的半衰期缩短，而在过度表达OTUD1的细胞中，IREB2的半衰期延长。此外，流式细胞术分析表明，氯化血红素或AFC处理抑制了TFRC的表达，但OTUD1的过表达显著挽救了TFRC的表达(图1H)。与此一致，OTUD1的缺失限制了DFO诱导的TFRC上调(图1I)。为了确定OTUD1对TFRC表达的刺激作用是以IREB2依赖的方式进行的，作者使用CRISPR-Cas9敲除了CT26细胞中的Ireb2，OTUD1的过表达选择性地促进了野生型CT26细胞中TFRC的表达，这进一步证实了OTUD1对TFRC的调控需要IREB2。由此可见，OTUD1在结肠中是IREB2的一个真正的去泛素酶。
3、OTUD1在结肠癌中选择性降低
接下来，作者评估了OTUD1在结肠癌发生过程中的重要性。如图2A所示，结肠癌组织中OTUD1的mRNA水平显著低于邻近正常组织。根据上述数据，OTUD1促进了IREB2-TFRC信号的激活，OTUD1的转录与癌组织中TFRC的表达高度相关(图2B)。随后的Westernblot分析进一步证实了这一结果(图2C)。作者利用生物信息学以及免疫组织化学方法发现，与早期肿瘤相比，晚期肿瘤的OTUD1表达水平较低，OTUD1降低与肿瘤发展高度相关(图2D和E)。为了评估OTUD1在其他大肠疾病中的表达情况，作者检测了OTUD1在结肠炎、腺瘤性息肉和良性腺瘤中的表达。如图2F所示，OTUD1在结直肠癌中选择性下调。
4、OTUD1的缺失限制了铁的运输
为了进一步确定OTUD1在铁转运中的作用，作者用氯化血红素以及AFC处理细胞，从而评估细胞内的铁浓度。如图3A所示，OTUD1的过表达而不是其催化失活(CS)突变体促进了细胞对铁的摄取。与OTUD1对野生型细胞中铁转运的刺激作用相比，OTUD1的存在对Ireb2-/-细胞的铁吸收几乎没有影响，这进一步证实了IREB2在OTUD1调控TFRC中的重要作用。反过来，OTUD1的缺失限制了氯化血红素或AFC刺激时细胞内的铁浓度(图3B)。为了在体内进一步证实这一结果，作者采用CRISPR-Cas9技术获得了Otud1-/-小鼠。与OTUD1稳定IREB2蛋白的数据一致，OTUD1的缺失减弱了IREB2和TFRC在结肠中的表达，但不影响FBXL5的表达(图3C)。同时，作者比较了野生型和Otud1-/-小鼠口服葡萄糖酸亚铁1周后的铁吸收情况。如图3D所示，与产仔对照相比，OTUD1的缺失显著限制了肠道铁的浓度。此外，作者还用缺铁饮食测试了野生型和Otud1-/-小鼠。如图3e-G所示，与野生型小鼠相比，两周的缺铁饮食降低了Otud1-/-小鼠的平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。与野生型小鼠相比，低铁饮食处理4周后，Otud1-/-小鼠的红细胞(RBC)计数、血红蛋白(Hb)和红细胞压积(Hct)均较低(图3H、图I)。综上所述，OTUD1的丢失抑制了铁的运输，并增强了对缺铁性贫血的易感性。
5、OTUD1在肿瘤中激活IREB2-TFRC信号并抑制肿瘤生长
为了研究OTUD1在肿瘤发生中的生物学功能，作者重组了OTUD1在结肠癌细胞中的表达。出乎意料的是，OTUD1的增强表达对肿瘤细胞的体外增殖几乎没有影响。为了测试OTUD1是否影响宿主对癌症的免疫监视，作者将同等数量的表达OTUD1的以及表达OTUD1（CS）的CT26细胞移植到BALB/c小鼠的背侧，并监测肿瘤的生长，发现OTUD1的增强表达对体内肿瘤生长有抑制作用。
由于OTUD1在体外对IREB2的刺激作用，表达OTUD1的肿瘤比表达OTUD1CS的肿瘤表达更高水平的IREB2(图4F)。Westernblot和流式细胞术分析都表明，OTUD1选择性地上调了TFRC的表达(图4F-H)。此外，通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析，作者发现表达OTUD1的肿瘤细胞内铁浓度显著高于表达OTUD1CS的肿瘤(图4I)。由于OTUD1的抑瘤作用在免疫活性小鼠中是选择性的，作者推测OTUD1-IREB2-TFRC轴的激活可能增强了宿主的免疫应答，因此研究了肿瘤发展过程中肿瘤浸润性淋巴细胞的状态，发现表达OTUD1的肿瘤中CD8+T细胞的百分比增加。为了研究OTUD1是否影响T细胞的效应功能，作者检测了肿瘤浸润淋巴细胞上PD-1的表达，发现表达OTUD1的肿瘤中分离出的CD8+T细胞中的PD-1水平低于来自模拟肿瘤的CD8+T细胞(图4L)。作者认为，OTUD1激活了癌症中的IREB2-TFRC信号，并增强了宿主对癌症的免疫应答。
6、OTUD1上调增加细胞对铁死亡的敏感性
为研究OTUD1抑制肿瘤生长的机制，作者对野生型和OTUD1-/-细胞进行了定量蛋白质组学分析。如图5A所示，与IREB2和TFRC的减少相反，氧还原酶如Gpx4和ALDH3A1的表达在OTUD1缺乏的细胞中上调。接下来，作者分析了OTUD1表达对氧化应激的反应，发现OTUD1的过表达显著增强了过氧化氢诱导的细胞死亡，而OTUD1的缺失则对细胞死亡产生了相反的影响。值得注意的是，铁死亡抑制剂铁抑素-1(Fer-1)可以逆转OTUD1诱导的增强的细胞死亡(图5C)。为了进一步证实，作者用铁死亡激活剂(RSL3、Erastin)处理OTUD1、OTUD1CS，发现OTUD1的过表达增强了细胞对细胞死亡的敏感性，OTUD1的缺失抑制了RSL3或Erastin诱导的细胞死亡(图5e)。同时作者用DCFDA检测了表达OTUD1、表达OTUD1CS的细胞和对照细胞中ROS的状态，发现在铁死亡激活剂的处理下，OTUD1的过表达促进了ROS的产生。
为了测试OTUD1是否能在体内增加细胞对铁死亡的敏感性，作者在表达OTUD1的肿瘤中检测到比表达OTUD1CS的肿瘤更多的ROS。为了确定脂质氧化增加主要有助于OTUD1介导的肿瘤抑制，作者使用了自由基清除剂维生素E(VE)来抑制铁死亡。体外实验表明，NP-VE处理可抑制RSL3诱导的OTUD1表达细胞的铁死亡。在小鼠模型中发现，NP-VE治疗降低了OTUD1的肿瘤抑制作用。此外，流式细胞术分析显示，NP-VE治疗显著降低了模拟和OTUD1表达的肿瘤细胞内ROS水平。值得注意的是，补充NP-VE也降低了CD8+肿瘤浸润T细胞的比率(图5K)。以上数据表明，OTUD1促进氧化应激下的铁死亡。
7、OTUD1触发DAMP，刺激免疫反应
文献表明，非凋亡性细胞死亡可以触发危险相关模式分子(DAMP)的释放，进而增强免疫反应。为了评估铁死亡是否也有助于这一过程，作者用不同细胞死亡诱导剂处理的癌细胞的ATP连接，发现与其他类型的细胞死亡相比，铁死亡诱导死亡细胞释放更多的ATP。此外，OTUD1的过表达加剧了RSL3对ATP释放的影响，而OTUD1的缺失不仅限制了细胞死亡，而且限制了ATP的释放(图6A和B)。为了在体内进一步证实，作者对肿瘤间质液(TIF)进行了质谱分析，发现在OTUD1存在的情况下，TIF中积累了多个阻尼(图6C)。随后的Westernblot分析进一步证实，与对照肿瘤相比，OTUD1的过表达增加了TIF中HSP70、HSP90和HMGB1的释放(图6D)。同时，OTUD1的强制表达增加了ATP的释放(图6e)。此外，作者在小鼠左侧皮下接种表达CT26细胞的空载体或OTUD1，发现OTUD1表达细胞免疫的小鼠CT26细胞的生长受到明显的抑制。综上所述，OTUD1促进了细胞内的铁积累，促进了氧化损伤，进而增加了铁死亡，最终增强了宿主的免疫反应。
8、OTUD1缺失增加了结直肠癌的敏感性
为了研究OTUD1的缺失是否会增加体内癌症的敏感性，作者使用偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎相关癌症。Otud1-/-小鼠肿瘤显示出相当快的生长速度(图7A和B)。同时肿瘤数量也有所增加(图7C和D)。流式细胞术分析显示在Otud1-/-肿瘤中TFRC的表达受损(图7E)。
接下来，作者使用全基因组RNA测序(RNA-seq)分析野生型和Otud1-/-肿瘤中差异表达的基因。利用基因集富集分析(GSEA)，发现OTUD1的缺失抑制了免疫反应信号相关的基因的表达(图7F)。PAN-T淋巴细胞标记CD3染色进一步证实了这一结果，显示与野生型小鼠相比，Otud1-/-小鼠结肠癌中的淋巴细胞浸润较少(图7G)。接下来，作者用流式细胞术分析了OTUD1缺乏引起的T细胞抑制，发现与野生型小鼠相比，Otud1-/-小鼠的CD8+T细胞在固有层单核细胞(LPMCs)、Peyer补丁(PP)和肠系膜淋巴结(MLNs)中的频率降低，同时其细胞内ROS含量和细胞外ATP浓度均降低，免疫反应受损(图7I和J)。综上所述，OTUD1缺失增强了对免疫原性细胞死亡的抵抗力，并限制了宿主免疫反应，最终增加了结肠癌的易感性。
三、讨论
目前的研究明确了OTUD1在结肠癌发生中的肿瘤抑制作用。在结肠癌中，OTUD1的缺失导致IREB2泛素化和降解，进而抑制TFRC的表达，限制铁的转运，最终增强肿瘤细胞对铁下垂和免疫清除的抵抗力。因此，OTUD1作为铁代谢调节剂的发现为肿瘤免疫治疗提供了一个潜在的靶点。
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