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01
何为真菌？
上海微生物显色平板培养艺术大赛▲徐和平/摄
基本特征
①真核细胞型微生物，属于真菌界；
②具有典型细胞核，有完整的细胞器，不含叶绿素，不分根、茎、叶；
③单核细胞或多核细胞组成的；
④细胞壁含几丁质和β-葡聚糖；
④以寄生或腐生的方式生存，能进行有性生殖或（和）无性生殖
⑤致病性：引起人类感染性、中毒性、变态反应性疾病。
真菌的分类
（1）分类单位：
（2）按形态分：
①单细胞真菌：
酵母菌：如新生隐球菌，以出芽方式繁殖，不形成真假菌丝；
酵母样菌：如念珠菌属，以出芽形成芽管，形成假菌丝。
②多细胞真菌：
由菌丝+孢子组成丝状菌（霉菌）形成菌落为丝状型，如：曲霉、毛霉、青霉、皮肤癣菌等、各种霉菌的菌丝和孢子形态不同，是鉴别真菌的重要标志。
「菌丝」:呈管状，长度随不同的生长条件而异，是由成熟孢子以出芽方式繁殖时形成的。在适宜的环境中由孢子长出芽管，并长出分支而不断生长形成的或有一段菌丝细胞增长而形成，许多菌丝交织成团，成为菌丝体。
A.按形态不同：
螺旋状、球拍状、结节状、鹿角状、梳妆、关节状菌丝等。
B.按结构不同：
有隔菌丝：是由横隔将管状结构的菌丝分隔成一连串多细胞样的丝状体如霉菌、青霉和毛癣菌菌丝（大多致病菌为有隔菌丝）。
无隔菌丝：无隔膜整条菌丝为单个细胞，细胞质内有多个细胞核，根霉和毛霉的菌丝。
C.根据菌丝生长方式（功能）不同分:
营养菌丝：伸入到培养基内的菌丝。
气生菌丝：露出培养基表面、向空间生长。
生殖菌丝：气中菌丝可生产有性或无性孢子。
菌丝的结构和组成是真菌形态的的一个重要的特征，这有助于对真菌的鉴别。
「孢子」：是真菌的繁殖体，不同的真菌都有其特定的孢子，其形态、大小表面纹饰和色泽等各不相同。
根据繁殖的方式分为两种：
A.有性孢子：是经过两性细胞接合的繁殖方式，通常经过质配、核配和减数分裂三个过程。如：孢子菌丝、皮炎芽生菌、石膏样小孢子菌等。
B.无性孢子（多为病原性真菌繁殖方式）
无性孢子按形态不同分：
①分生孢子：真菌中最常见的一种。
大分生孢子：（多细胞性）其大小、细胞数和颜色是鉴定真菌的重要依据。
体积较大，分隔成较多细胞，长呈梭形，棍棒型，梨形
小分生孢子：（单细胞性）各种真菌都能产生小分生孢子，鉴别意义不大。
体积小，单细胞性外壁薄，有球型，卵形，梨形以棍棒状等各种不同的形态及。
②叶状孢子：菌丝内细胞直接形成。
芽生孢子：由细胞出芽生成，多数芽生孢子生长到一定大小即与母体脱离，若不脱离，形成菌丝状，被称为假菌丝。
关节孢子：菌丝生长到一定阶段后，出现很多横膈膜，然后从横隔膜处断裂形成矩形、筒形或短柱状的孢子。多出现与陈旧的培养物中。
厚膜孢子：菌丝或分支的顶端有少数细胞有菌丝内胞质浓缩、薄壁增厚形成，是为了抵抗不良环境，真菌的一种休眠体。环境适宜时又可出芽繁殖。
③孢子囊孢子：菌丝分支的顶端或孢囊梗膨大形成孢子囊，内含许多孢子，孢子成熟后则破囊而出。如毛霉、根霉等形成的孢子囊孢子。
02
真菌检验的基本技术
1.标本直接镜检
?生理盐水
?透明胶带法
2.染色镜检法
?革兰染色（为革兰阳性，为深紫红色）
?墨汁染色法
?乳酸酚棉蓝染色法
?荧光染色
?糖原染色（PAS）：真菌及组织内的多糖多糖-红色；核-蓝色;背景-淡绿色。
?银染色法
?吉姆萨染色、瑞氏—吉姆萨染色法
?病理组织染色法
3.真菌培养及鉴定
（1）培养方法
?点植法
?划线法
?直接培养与间接培养
?试管培养
?平板培养
?大培养
?小培养：玻片法、方块法、小钢圈法
（2）培养条件
?pH一般在5.0-7.0（大部分真菌适应中性或偏酸环境）；
?温度：多25-28℃，深部真菌一般37℃；二相真菌26℃左右，为菌丝相，37℃，酵母相。
?渗透压
（3）常用真菌培养基
4.培养真菌的菌落形态：
①酵母型菌落：（类似一般细菌菌落）菌落光滑、湿润、柔软、致密，似酵母。为单细胞真菌的菌落，以出芽方式繁殖，如新型隐球菌显微镜检可见圆形或椭圆形生芽细胞。
②类酵母型：外观性状同酵母型菌落，但除有生芽细胞外，还有假菌丝伸入培养基中，是由伸长的芽生孢子形成如白念珠菌。
③丝状菌落：菌丝疏松，呈棉絮状、绒毛状或粉末状等，一部分菌落向上生长并形成孢子，一部分深入培养基下层。菌丝正面和背面可显示各种不同的颜色，常作为鉴定菌种的参考。
6.临床标本的真菌学检查
（1）根据标本类型分为：
①血液标本
②骨髓标本
③中心静脉导管标本
④脑脊液标本
⑤痰、肺泡灌洗液、保护毛刷标本
⑥分泌物标本
⑦尿液标本
⑧粪便标本
（2）根据侵袭部位分：
皮肤黏膜感染性真菌：
①皮肤癣真菌
毛癣菌属
表皮菌属：只有絮状表皮癣菌致病
小孢子菌属
②表面感染真菌
③皮下组织感染真菌：引起头癣、足癣、股癣、甲癣、体癣
引起侵袭性感染性真菌：
①酵母型真菌：念珠菌属、隐球菌属
②丝状真菌：曲霉、毛霉、镰刀菌属
③卡氏肺孢菌
④二相性真菌：组织胞浆菌、马尔尼菲青霉、粗球孢子菌、副球孢子菌
「二相性真菌」:
二相性：有些真菌可因营养、温度、颜色等环境的改变，二两种形态发生互变。
二相性真菌：在体内或体外含动物蛋白的培养基上37℃培养为酵母型真菌；在体外普通培养基上25℃培养为霉菌型真菌，如球孢子菌、组织胞浆菌、芽生菌和孢子丝菌、副球孢子菌。
酵母型
霉菌型
▲徐和平/摄
03
实验室常见真菌
念珠菌属
1.分类
念珠菌属(Candida)（假丝酵母菌属）生物学上属于半知菌亚门，该属菌有多个种，常见致病的有11种。
白念珠菌(Candidaalbicans)（白假丝酵母菌）为最常见的致病菌。
白念珠菌（C.albicans）
热带念珠菌（C.tropicalis）
克柔念珠菌（C.krusei）
光滑念珠菌（C.glabrata）
季也蒙念珠菌（C.guilliermondi）
维斯念珠菌（C.viswanathii）
近平滑念珠菌（C.parapsilosis）
都柏林念珠菌（C.dublinniensis）
星形念珠菌（C.stellatoidea）
克菲念珠菌（C.kefyr）
2.临床意义
分布与自然界，通常存在与人的体表、口腔、上呼吸道、肠道和阴道黏膜
大多是人体正常菌群，感染可以是内源性的，也可是外源性的。
可侵袭多个部位，引起浅部和全身性感染
白念
女性的念珠性阴道炎、外阴炎；男性念珠菌龟头炎、包皮炎
体质虚弱的婴儿：鹅口疮念珠性阴道炎、外阴炎、肺炎、膀胱炎、肾盂肾炎和心内膜炎
中枢神经系统白念珠菌病：脑膜炎、脑膜脑炎、脑脓肿等
热带
先天性免疫缺陷的致病菌，可引起皮肤、黏膜和内脏念珠菌病
克柔
引起系统性念珠菌病，特别是先天性免疫缺陷患者和大量接受抗菌药物治疗的患者
光滑
人体一种腐生菌，可导致泌尿生殖道感染，也是新生儿的条件致病菌
3.生物学性状
①菌体圆形或卵圆形，革兰阳性，着色不均匀。
②以出芽繁殖,形成米色或灰色的酵母样菌落，有时表面有褶皱。
③组织内：可见芽生孢子和假菌丝。
玉米粉培养基：假菌丝、厚膜孢子
墨汁染色：阴性---没有荚膜
4.微生物检查学
①直接镜检：一般用于浅部念珠菌的检查，也可用于血、尿、脑脊液、活检组织等标本的检查。显微镜下观察，呈圆形或卵圆形的芽生孢子，假菌丝和菌丝。
克柔可见假菌丝成对分枝，有细长的芽生孢子；
光滑可见卵圆形芽生孢子，细胞尖端单芽，无真假菌丝不产生厚膜孢子
②分离培养及鉴定：可接种于沙保弱、血平板等培养基。沙保弱培养基，25℃或37℃培养1-4天
白念珠菌：乳白色、奶油色、隆起、表面湿润、光滑类酵母型菌落，镜检可见假菌丝和芽生孢子；
热带念珠菌：乳白色至奶油色、隆起、无光泽、或稍有光泽的菌落；
克柔念珠菌：生长快，菌落大，呈柔软、乳白色至乳黄色菌落。
光滑念珠菌：42℃可生长，25或37℃培养3日，形成光滑、湿润、隆起、白色和奶油色乳酪样较小菌落。
5.念珠菌的鉴定方法
①芽管形成试验：待测菌加0.5～1ml人或动物血清——镜检（37℃水浴1.5-4h)
结果：绝大部分白假丝酵母菌可形成典型的放大镜柄状芽管
并非所有的白念珠菌都形成芽管，需要设阴（热带念珠菌）阳（白念珠菌）性对照。培养时间不可过长，热带念珠菌在血清中培养6h或更久也可形成芽管。
②厚膜孢子形成试验：在玉米粉琼脂上，25℃-28℃孵育24-48h，念珠菌属中仅白念珠菌产生厚壁孢子。
③氯化三苯基四氮唑反应
白念-不变色（淡红）
热带-深红色或紫色
其它-红色
④商品化显色培养基
原理：是一类利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理。（显色底物：由产色基因和微生物部分可代谢物质组成，在特异酶作用下，游离出的显色基因显示一定颜色，观察颜色）
翠绿色菌落为白念珠菌，
铁蓝色菌落为热带念珠菌，
淡粉红色菌落为克柔念珠菌，
紫色菌落为光滑念珠菌
其它为白色
⑤G试验
G试验（1,3-β-D-葡聚糖）可特异性激活鲎变形细胞裂解物种的G因子，引起裂解物凝固）
G试验检测的是真菌的细胞壁成分——1,3-β-D-葡聚糖，人体的吞噬细胞吞噬真菌后，能持续释放该物质，使血液中含量增高。
原理：
1,3-β-D-葡聚糖能特异性激活反应主试剂中的G因子、凝血酶原等，引起显色基质中酰胺键的断裂，产生能在nm下的显色物质pNA，，引起吸光度的变化。进行定量检查。
临床意义：
适用于除隐球菌和接合菌（毛霉菌）外的所有深部真菌感染的早期诊断，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能确定菌种。以下情况可出现假阳性：
（1）使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料；
（2）静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；
（3）链球菌血症；
（4）操作者处理标本时存在污染。
⑥其他：抗原检测、抗体检测、核酸检测
隐球菌属
1.致病特点：一般为外源性感染，经呼吸道侵入人体，可由肺经血传播至脑及脑膜，也可侵犯皮肤、骨和关节。
▲徐和平/摄
?最易侵犯的是中枢神经系统，引起慢性脑膜炎，出现脑膜刺激症状。
?新生隐球菌病好发生于体质虚弱，免疫力低下者。如白血病、艾滋病、恶性肿瘤、糖尿病等病人。
?荚膜多糖是新生隐球菌重要的致病物质
2.生物学性状
?圆形的酵母型菌，外周有荚膜，折光性强。
?一般染色法不着色，难以发现。
?非致病的隐球菌在37℃不生长，无荚膜
▲徐和平/摄
3.微生物检验
（1）直接检查
①墨汁负染色：
通常用于检查脑脊液等涂片中的隐球菌，是涂片中检查隐球菌的首选方法
标本中菌体较大，呈较大的球型，菌体周围有肥厚的荚膜
②隐球菌荚抗原的检测：常见有乳胶凝集法、胶体免疫金层析法、酶联免疫吸附法等。
▲徐和平/摄
③PCR检测
（2）分离培养
菌体常见出芽现象、在沙保弱和血平板上25℃和37℃均可生长。但30℃生长良好，菌落奶白色至棕黄色，粘稠、不透明、边缘完整。
（3）鉴定：
①尿素酶试验：
新型隐球菌（+）、白假丝酵母菌（-）
②糖同化及发酵试验：
新型隐球菌、浅白隐球菌等可同化纤维二糖、肌醇等，但均不能发酵糖类。
③酚氧化酶试验：
接种左旋多巴-枸橼酸铁和咖啡酸培养基，经2-5天，新型隐球菌呈棕黑色菌落。
曲霉菌
1.基本特征
?多数只发现了无性阶段，
?条件致病菌，最常见的是烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉
?可侵犯机体许多部位，尤其是呼吸系统和全身性曲霉病。
?呼吸系统曲霉菌病引起支气管哮喘或肺部感染。
?全身性曲霉菌病原发病灶主要是肺，可随血播散至脑、心肌和肾等。
?有些曲霉菌能产生毒素引起机体食物中毒，黄曲霉毒素，杂色霉毒素有致癌作用。
2.生物学特征：
▲徐春晖/绘
组成：分生孢子头和足细胞
分生孢子头：分生梗茎、顶囊、瓶梗
梗基、分生孢子链
壳细胞：厚壁，顶生或间生的囊状细胞
▲徐和平/供
闭囊壳：有性生殖器官，壁薄，由一层或数层多角细胞构成
▲徐和平/摄
3.分离培养
?曲霉菌在沙保培养基上，室温及37℃～45℃均能生长
?形成绒毛状或絮状菌落
?菌落开始为白色，随着孢子的产生，不同菌种可呈现各种不同的颜色
?多数菌种只有无性阶段，少数菌种存在有性阶段
烟曲霉
?菌落扩延，蓝绿色至烟绿色，背面无色或黄褐色，绒毛状，37~45摄氏度生长良好。
?顶囊烧瓶状：单层瓶梗，布满顶囊表面2/3；分生孢子头圆柱形；分生孢子梗无色或绿色、光滑，无闭囊壳。
?引起肺曲霉病
黄曲霉菌
▲徐和平/供
?菌落表面黄绿色，背面无色或微褐色，羊毛状
?顶囊近球形；单层和/或双层小梗，布满顶囊表面；分生孢子头放射状或圆柱状。孢子梗黄绿色、粗糙
?引起肺、外耳道曲霉病，甲癣
黑曲霉菌
?生长迅速，菌落初为白色羊毛状，后为黑色或黑褐色粗绒状，背面无色或略带黑褐色
?顶囊近球形；单层和/或双层瓶梗；分生孢子头球形放射状，褐色至黑色；孢子梗无色至褐色、光滑
?引起外耳道、肺和脓皮症样曲霉
其他霉菌
土曲霉菌落
杂色曲霉菌落
构巢曲霉菌落
4.微生物检验
（1）显微镜检查
①透明胶带法
可有效的保持菌落的生长形态，便于观察真菌的产孢子结构及着生方式和孢子的排列方式。制片的过程应在生物安全柜中进行，疑为二相真菌，除孢子丝菌外不可采用此法。
在显微镜下的特征性表现：
可见较多的分生孢子头，顶端膨大形成顶囊，顶囊上有小梗，小梗上有许多小分生孢子，透明二叉分支形（分枝呈45°角）
有隔菌丝
黄曲霉菌
烟曲霉菌
黑曲霉菌
②乳酸酚棉蓝染色法
（2）抗原、抗体的检测：
包括抗原、抗体及代谢产物检测
?抗原检测：抑制性ELISA患者血清中的曲霉菌抗原，如GM试验
?抗体检测：检测患者血清中抗曲霉抗体，常用免疫扩散，对流免疫、ELISA、放射、间接荧光等
?代谢产物：G试验检测细胞壁成分1-3-β-D甘露聚糖
G试验检+GM试验可提高曲霉的检出率
GM试验（Galactomannan）
----目前国际公认的曲霉菌的诊断方法
GM试验检测的是半乳甘露聚糖，主要适于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断。曲霉菌特有的细胞壁多糖成分是β（1-5）呋喃半乳糖残基，菌丝生长时，半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原。GM释放量与菌量成正比，可以反映感染程度。连续检测GM可作为治疗疗效的监测。在造血干细胞移植患者中的诊断敏感性高。
一步法酶免夹心微孔板方法检测人血清中的半乳甘露聚糖,采用鼠EBA-2单克隆抗体，直接和曲霉菌半乳甘露聚糖结合。
将鼠EBA-2单克隆抗体微孔板并结合抗原，且检测结合到已激活微孔板（结合物试剂：过氧化物酶连接的单克隆抗体）上的抗原。将已经过加热处理（以便去除免疫复合物和沉淀可能干扰实验的血清蛋白质）的EDTA血清样本加入孔中。孵育——洗板——加底物（显蓝色）——加入酸溶液终止反应（蓝色变黄色）——比色（nm和/nm波长的分光光度计（酶标仪）测定样本和对照的吸光度（光密度））
?以下情况可出现假阳性：
（1）使用使用半合成青霉素尤其是哌拉西林/他唑巴坦；
（2）新生儿和儿童；
（3）血液透析；
（4）自身免疫性肝炎等；
（5）食用可能含有GM的牛奶等高蛋白食物和污染的大米等。
?以下情况可出现假阴性：
（1）释放入血循环中的曲霉GM（包括甘露聚糖）并不持续存在而是会很快清除；
（2）以前使用了抗真菌药物；
（3）病情不严重；
（4）非粒细胞缺乏的患者
03
案例分析
患者胡某，男，21岁，因“骑车摔伤致胸腹部、腰部疼痛4小时”入院。
该病人基本特征如下：
1.患者为男性青年，既往体健。否认“肝炎”、“结核”病史，否认“糖尿病”、“冠心病”病史，否认食物、药物过敏史，否认重大手术，外伤史。
2.患者约于4小时，骑车摔伤致胸腹部、腰部疼痛，致全身多处流血，伴胸闷，当时神志清楚。送我院急查。
各种炎症指标均增高，临床医生一直在使用抗感染的药物防止细菌感染。
11月初因患者病情加重，给予气管切开接呼吸机支持呼吸后，与患者血液中检测到白念珠菌，且G试验、GM试验均明显增高。
临床医生给予卡波芬净等抗菌药物给予治疗，后期检查。血中未查到白念珠菌。
04
提提神，动动脑
1.鉴定曲霉常用的培养基是:
A、察氏琼脂
B、尿素琼脂
C、脑心葡萄糖血琼脂
D、酵母浸膏磷酸盐琼脂
E、沙氏培养基
2.真菌性脑膜炎最常见的病原菌:
A、白假丝酵母菌
B、曲霉菌
C、毛霉菌
D、新型隐球菌
E、球孢子菌
3.属于假丝酵母菌的特点：
A、革兰染色阳性，着色均匀
B、有菌丝和孢子
C、无假菌丝
D、沙氏培养基生长良好
E、菌落呈绒毛状
4.上呼吸道感染应采集：
A、鼻咽拭子标本
B、咽拭子标本
C、痰标本
D、支气管镜标本
E、胃内标本
上期答案：1.E2.C3.CE4.BCE5.ABCDE(你答对了吗)
05
教师补充
1、曲霉和毛霉的鉴别要点:①曲霉有隔，毛霉无隔②曲霉呈透明二叉分支（分枝呈45度角），毛霉无分枝
2、质谱仪:将待检菌薄薄涂于靶板上（96孔）加甲酸破坏细胞壁释放出蛋白质等物质待干后加基质与释放出来的蛋白质结合形成结晶，根据结晶大小进行打条带，与质谱库菌进行对比。
3、在实验室中一定要注意生物安全，学会保护自己，操作中注意无菌操作
4、G实验鉴别深部真菌（主要是念珠菌）、GM实验鉴别曲霉，都是辅助诊断的的指标，影响因素比较多。
指导老师：
“张丽副主任技师，资深检验人。从事医学检验工作及教学二十余年，发表论文多篇。临床经验丰富，带教风格严谨认真，亲切和蔼。
”特别鸣谢
往期回顾
啊！我好柔弱之贫血几种
血小板都去哪儿了
风云令再起，检验人的江湖，且行且学习
大咖发出集结令，谁的主题谁主
整理美编I蒋曼莉
审校I李洪春
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