真菌染色技术及应用（上）
常规染色法
F墨汁染色
原理：新型隐球菌的荚膜很厚，荚膜多糖不与墨汁着色，使得整个菌细胞在墨汁黑色背景下显得更加反光而易于观察。
方法：1、脑脊液离心备用2、取一滴KOH溶液滴加在载玻片上3、吸取适量底层脑脊液加到滴有KOH的溶液上4、取一滴中国墨汁滴加到脑脊液与KOH的混合液中，混匀5、静置后加盖玻片，镜下观察。
应用：脑脊液的新型隐球菌感染。但该方法有一定的局限性，阳性率相对较低，并且在治疗结束后的病人脑脊液中仍可找到的芽生孢子是否有活性，不能作为治愈性的观察指标。因此不主张用墨汁染色作为脑脊液中新型隐球菌的常规检测方法。
补充：墨汁染色阳性应结合隐球菌培养及乳胶凝集检测实验。
F乳酸酚棉兰染色
原理：真菌的嗜酸性物质能与棉兰染料结合，使真菌着色呈蓝色，并且乳酸棉兰为酸性物质，可以破坏真菌的内环境，起到灭菌的作用。
染液：苯酚(分析纯)20g乳酸20ml甘油40ml棉兰(Cottonblue)0.05g蒸馏水20ml
将苯酚、乳酸、甘油溶解于蒸馏水中，加热搅拌至溶解，加入棉兰混匀分装备用。
方法：1、角质性待查标本于载玻片上2、滴加少量KOH溶液溶解角质（溶解角质后可以滤纸吸取KOH溶液）3、滴加适量乳酸酚棉兰染液4、加盖玻片压片，静置，镜检
应用：真菌的常规形态学镜检
补充：染色方法过程中如果角质细胞不多KOH溶液可以省去。标本为菌落菌丝观察时，KOH溶液可以不用或用蒸馏水代替。染液中的甘油可以使涂片保存一定的时间，易于观察。用中性树胶把盖玻片边缘封住，可以保存更长时间。
F革兰染色
原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在真菌细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，由于真菌的细胞壁较厚、葡聚糖、几丁质交联致密，故乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；因此真菌革兰染色呈阳性反应。
染液：
1、结晶紫染液
结晶紫2.0g草酸铵0.8g95％酒精20ml蒸馏水80ml
先将结晶紫溶于酒精，草酸铵溶于蒸馏水中，然后将两液混合，静48小时使用。此染液稳定，置密闭的棕色瓶中可储存数月。
2、碘液
碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水ml
先将碘与碘化钾混合，加水少许，略加摇动，待碘完全溶解后再加蒸馏水至定量。
3、脱色剂：95％酒精
4、复染剂：番红（沙黄）染液
沙黄0.25g95％乙醇10ml蒸馏水适量
将沙黄溶解于９５％乙醇中，待完全溶解再加蒸馏水至ml
（参考细菌革兰染液配制）
方法：1、阴道分泌物及皮肤破溃脓液涂抹载玻片上，涂片要均匀，厚度适当2、载玻片在酒精灯上微微加热，使水分蒸发。勿靠近火焰或长时间加热，防止标本烤枯变形。3、加结晶紫染液初染1min4、小股水冲洗至无色后加碘液染1min5、水洗后滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗6、滴加沙黄溶液染色1min后水洗，镜检。
应用：适合于所有真菌、放线菌及诺卡菌。尤其为阴道分泌物标本及皮肤溃烂性脓液，更容易操作。
补充：角质性标本可以加入KOH溶液后再酒精灯上缓慢加热达到固定的目的。光镜下为了观察真菌及放线菌结构时，可以滴加镜油后，油镜观察。阴道分泌物时，可以同时观察线索细胞、淋球菌、滴虫及细菌的感染。
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