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学海无涯临床微生物第二十八章真菌检验

●考点　　真菌的基本特性　　真菌微生物学检查方法　　念珠菌；隐球菌；曲霉菌；皮肤真菌　　　　真菌：　　真核细胞型微生物，属于真菌界。具有典型细胞核，不含叶绿素，不分根、茎、叶。以寄生或腐生方式生存。由单细胞或多细胞组成的，细胞壁含几丁质和（或）纤维素。能进行有性生殖和（或）无性生殖。

（二）真菌的结构　　菌丝　　孢子　　菌丝：　　真菌在适宜环境中，由孢子生出芽管逐渐延长呈丝状。菌丝继续生长并向两侧分枝，交织成团，称为菌丝体。　　孢子　　有性孢子：　　由同一个菌体或不同菌体上的两个细胞融合形成。　　包括卵孢子、接合孢子、子囊孢子和担孢子。　　无性孢子：　　由菌丝直接生成，并不发生细胞融合。　　致病性真菌多为无性孢子。

　　真菌菌落有3种类型：　　1.酵母型菌落：类似一般细菌菌落，菌落光滑、湿润、柔软、致密，显微镜检查可见圆形或椭圆形生芽细胞。　　2.酵母样菌落：外观性状同酵母型菌落，但在菌落表面除有芽生细胞外，还有假菌丝伸入培养基中，如白色念珠菌。　　3.丝状菌落：菌落疏松，呈棉絮状、绒毛状或粉末状，菌落正面和背面可显示各种不同的颜色，常作为鉴定菌种的参考。　　（四）真菌抵抗力　　对热的抵抗力不强，一般60℃1h即被杀死。　　对干燥、日光、紫外线及多数化学药品的耐受性较强。　　用甲醛熏蒸被真菌污染的物品，可达到消毒的目的。　　对常用抗生素如四环素、青霉素、链霉素等均不敏感，灰黄霉素、制霉菌毒、两性霉素等对某些真菌有抑制作用。

　　三、致病性　　1.致病性真菌感染　主要是一些外源性真菌感染，可引起皮肤、皮下及全身性真菌感染。　　2.条件致病真菌感染　主要是一些内源性真菌引起的，如假丝酵母菌、曲霉菌、毛霉菌等。　　3.真菌变态反应性疾病　在临床变态反应性疾病中有一部分是由真菌引起的。常见的变态反应性疾病有荨麻疹、接触性皮炎、哮喘等。　　4.真菌性中毒　有些真菌在粮食和饲料上生长，人、畜食用后可导致急性或慢性中毒，引起中毒的可以是真菌本身,也可以是真菌产生的毒素。　　5.真菌毒素与肿瘤的关系　近年来不断发现有些真菌产物与肿瘤有关，例如：黄曲霉毒素有较强致癌作用,摄入一定量的黄曲霉毒素可导致肝癌。

第二节　真菌的基本微生物检验方法

　　真菌检查方法，常用直接检查、培养检查，一般即可确定致病真菌的种类，必要时可用生化反应、皮肤试验、免疫学检查、核酸检查以辅助诊断。　　一、真菌的直接检测法　　（一）不染色标本的直接检查　　将少量标本置于载玻片上，加适量生理盐水，如为毛发、皮屑，须加10%～20%氢氧化钾，盖上盖玻片，并加热使标本组织溶解透明，用低倍镜和高倍镜检查，观察时有酵母型细胞、菌丝、菌丝体和孢子。若发现有真菌菌丝或孢子存在时可初步判定为真菌感染。　　（二）染色标本检查　　观察有无酵母型细胞、菌丝、菌丝体和孢子。　　1.革兰染色　　适用于酵母菌和类酵母菌的染色。　　酵母型细胞和菌丝、孢子被染为革兰阳性。　　2.墨汁负染色　　适用于隐球菌的检查。可见新型隐球菌具有宽厚荚膜。　　3.乳酸酚棉兰染色　　适用于各种真菌的检查。　　酵母型细胞，菌丝和孢子被染为蓝色。　　4.瑞氏染色　　适用于检测骨髓和外周血中的荚膜组织胞质菌。　　（三）直接检测抗原　　用乳胶凝集试验、ELISA检测血清和脑脊液标本中的隐球菌抗原。　　用胶乳聚集试验检测标本中白假丝酵母菌抗原。

　　（二）培养方法　　1.试管培养　是真菌分离培养、传代和保存菌种最常用的方法。将标本接种在琼脂斜面上，每个标本接种两支琼脂斜面，一支放于37℃，另一支放于22～28℃，需氧培养。　　2.玻片小培养　主要用于在显微镜下观察真菌的自然形态和结构及生长发育的全过程。可用于真菌菌种的鉴定。　　3.平皿培养　表面较大可使标本散布，便于观察菌落形态，但水分易蒸发，只能培养生长繁殖较快的真菌。　　三、鉴定　　主要依靠菌落特点、菌丝和孢子的形态特点，菌丝体上有无特殊的结构。　　生化反应：常用的有糖类发酵试验、同化碳源试验等。　　动物试验　　核酸检测　　真菌毒素的检测

　　（二）微生物学检查　　1.直接镜检：　　一般用于浅部念珠菌病检查，也可用于血、尿、脑脊液、活检组织等标本的检查。显微镜下观察，念珠菌呈圆形或椭圆形的芽生孢子，假菌丝和菌丝。G+，但着色不均。　　2.分离培养及鉴定：　　可接种沙保弱、血平板等培养基。　　常用的白色念珠菌的鉴定方法有：　　（1）芽管形成试验：　　接种于血清中，37℃孵育3小时（一般不超过4小时），镜检观察酵母细胞是否形成了芽管。　　念珠菌属内的大多数白色念珠菌可形成芽管，但也不尽然，同时也会有假阳性。试验最好有阴性和阳性对照。　　（2）糖同化或发酵试验：根据这两种实验可将常见的几种假丝酵母菌进行鉴别。　　（3）厚壁孢子形成试验：在玉米粉琼脂上，25℃～28℃孵育24～48小时，念珠菌属中仅白色念珠菌产生厚壁孢子。　　（4）商品化产色培养基可用于快速鉴定。　　（三）临床意义　　对人类有致病性的主要有：白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌等。其中以白假丝酵母菌的感染最为常见。　　大多是人体正常菌群，感染既可以是内源性，也可以是外源性的。　　假丝酵母菌可引起浅部和全身性感染。　　浅部假丝酵母菌病包括鹅口疮、阴道炎、角膜炎、甲沟炎等。口腔假丝酵母菌病与艾滋病关系密切。　　全身性感染依其侵犯部位及患者状态而表现不同临床症状。有支气管和肺假丝酵母菌病、假丝酵悬菌性肠炎，假丝酵母菌性膀胱炎或肾盂肾炎、假丝酵母菌性心内膜炎等。　　（四）治疗原则　　对浅部感染者，可外用药物和口服药物联合治疗。　　对深部感染者，可选用口服或注射抗真菌药物治疗，如酮康唑、氟康唑及伊曲康唑等。　　二、隐球菌　　（一）生物学性状　　圆形的酵母型菌，外周有荚膜，折光性强。一般染色法不着色，难以发现。印度墨汁作负染色镜检，在黑色的背景中可见圆形的透明菌体，为双壁细胞，外包有一层透明的荚膜。菌体常见有出芽现象。在沙保弱和血琼脂上，25℃和37℃均可生长，而非致病的隐球菌在37℃则不生长。　　（二）微生物检验　　1.直接检查　　墨汁负染色—标本中菌体较大，呈较大的球型，菌体周围有肥厚的荚膜。乳胶凝集试验、ELISA检测血清和脑脊液标本中的隐球菌荚膜多糖特异性抗原。PCR检测。　　2.分离培养及鉴定　　在沙保弱培养基上，25℃及37℃均可生长，菌落白色或奶油色，黏稠，不透明。　　以下试验进行鉴定：　　（1）尿素酶试验：新型隐球菌（+），白假丝酵母菌（-）。　　（2）糖同化及发酵试验：新型隐球菌，浅白隐球菌等可同化纤维二糖、肌醇等，但均不能发酵糖类。　　（3）酚氧化酶试验：接种左旋多巴-枸橼酸铁和咖啡酸培养基，经2～5天，新型隐球菌呈棕黑色菌落。　　（三）临床意义　　致病物质是荚膜。　　属外源性感染。　　经呼吸道侵入人体，经血流播散至脑及脑膜，也可侵犯皮肤、骨和关节。　　隐球菌病好发于免疫功能低下者，特别是隐球菌性脑膜炎常在系统性红斑狼疮、白血病、淋巴瘤、艾滋病等疾病患者中发生。　　（四）治疗原则　　抗真菌药物：两性霉素B.氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑等。　　对于神经系统隐球菌感染,一般主张分期治疗。初期可应用两性霉素B和氟胞嘧啶联合治疗，尽快使脑脊液转阴；后期可口服咪唑类抗真菌药物，维持3～4个月，以防复发。　　三、曲霉菌　　（一）形态特征　　有隔菌丝。　　分生孢子产生在由菌丝分化出来的分生孢子梗顶部。分生孢子梗多不分枝，有或无横隔。其顶端膨大形成顶囊，顶囊表面直接产生瓶梗，为单层。或者先产生梗基，再由梗基上生出瓶梗，即为双层，瓶梗顶端生成分生孢子。　　（二）分离鉴定　　在沙保弱培养基上形成丝状菌落，开始为白色，随着分生孢子的产生而呈现各种颜色。　　常用察氏琼脂，菌落气生部分（分生孢子头等）和基内菌丝体以及培养基的颜色是鉴定菌种的依据之一。　　（三）血清学诊断　　用ELISA.RIA等方法检测患者血清中的抗体。　　用ELISA等方法检测患者血清、尿液或其他体液中的抗原。　　（四）皮肤试验　　对过敏性支气管肺炎患者可用曲霉菌抗原提取液作皮试。　　（五）临床意义　　条件致病菌。　　可侵犯机体许多部位，尤其是呼吸系统和全身性曲霉病。呼吸系统曲霉病引起支气管哮喘或肺部感染。全身性曲霉病原发病灶主要是肺，可随血播散至脑、心肌和肾等。　　有些曲霉菌能产生毒素引起机体食物中毒，黄曲霉毒、杂色霉素有致癌作用。　　四、毛霉目真菌　　常引起毛霉病的有：根霉属、犁头霉属、毛霉属、根毛霉属，其中以根霉属最为常见。　　毛霉病是一种发病急，进展快、病死率极高的系统性条件致病性真菌感染。免疫功能低下者易感。　　临床上常见眼眶及中枢神经系统的毛霉病。该病起初多发于鼻黏膜或鼻窦，继而扩散。　　标本直接镜检可见折光性强的粗大菌丝，无隔或少数分隔，偶见孢子囊及孢子囊梗。　　在培养基上生长较快，初起菌落表面呈棉花样、白色，渐变为灰褐色或其他颜色，顶端有黑色小点。　　依据菌落及镜检特征进行鉴定。　　五、组织胞浆菌　　双相性真菌。　　主要侵犯网状内皮系统。有时也可由血行播散而侵犯全身各脏器。　　引起三种不同临床表现：原发急性型组织胞浆菌病、慢性空洞型、严重播散型。　　标本涂片姬姆萨染色可见在巨噬细胞内卵圆形较小的一端有出芽，为可疑标本。　　六、卡氏肺孢菌　　主要是空气传播，在健康人体内多为无症状的隐性感染。　　当宿主免疫力下降时，导致间质性浆细胞肺炎，又称卡氏肺孢菌肺炎（PCP）。是AIDS最常见、最严重的机会感染性疾病。　　有包囊和滋养体两种形态。包囊为感染型，滋养体为繁殖型。痰液涂片姬姆萨染色检查包囊。利用单抗查血清中的卡氏肺孢菌抗原。也可检测核酸。　　浅部感染真菌　　1.毛癣菌属　　侵犯人体皮肤、指（趾）甲、毛发的角蛋白组织　　皮屑等经10%KOH溶液消化后镜检，可有菌丝；病发内、外可见菌丝或孢子　　皮肤癣菌对伊曲康唑等药物敏感　　2.表皮癣菌属　　对人致病的只有絮状表皮癣菌　　3.小孢子菌属　　感染皮肤和毛发，很少感染指（趾）甲　　4.糠秕马拉色菌：引起皮肤表面真菌感染　　5.着色真菌和孢子丝菌：可引起皮下组织真菌感染　　马尔尼菲青霉　　特征：双相真菌，自然界以菌丝形式存在，组织中呈小圆形至椭圆形细胞　　致病：马尔尼菲青霉病，引起广泛性、播散性感染　　最初通过吸入而致肺部感染，随后进入血流引起菌血症，并随血流播散引起其他部位感染　　继发感染常见　　检查：涂片染色镜检，可见到典型圆形或卵圆形有明显横隔的孢子，常在巨噬细胞内。　　治疗：对米卡芬净、两性霉素B及伊曲康唑等敏感。　　镰刀菌　　广泛分布于自然界土壤、植物的地上及地下部分。　　标本直接检验——可见分支、分隔的透明菌丝，偶见镰刀状大分生孢子。　　大分生孢子是镰刀菌的特征；有无小分生孢子是镰刀菌分类的主要特征；有无厚壁孢子也是镰刀菌分类的主要特征。

　本章小结：　　

　　一、真菌的基本特性　　二、真菌微生物学检查方法　　三、常见的病原性真菌

（念珠菌；隐球菌；曲霉菌；皮肤真菌）

小试牛刀

一、A1

1、真菌人工培养的条件，正确的是（　）。

A、培养基中必须含有非常丰富的营养物质

B、最适pH9.0

C、大部分真菌最适温度为25～28℃

D、需5%～10%CO2环境

E、培养时间为24小时

大部分真菌在25℃～28℃生长良好，有些需要37℃培养，所有分离标本应孵育至少4周。