珍贵橙色束丝放线菌生产安丝菌素P-3的发酵工艺
FermentationProcessofAnsamitocinP-3byActinosynnemapretiosum
沈晓放，伊丹，陈少欣*
(中国医药医院工业研究院，创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海)
摘要：将安丝菌素P-3(1)产生菌珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnemapretiosum)的紫外诱变高产菌株A.pretiosumSIPI-U-76，通过5L发酵罐进行小试工艺研究，表明搅拌剪切力对1产量有明显的影响。采用降低搅拌转速、减少种子培养时间和调整发酵配方的方法，在5L发酵罐上1的发酵单位可优化达到mg/L。将优化后的小试工艺放大至L和L罐上，发酵单位分别达到和mg/L，较未优化的5L发酵罐上的1发酵单位(23mg/L)提高了11.5倍和12.8倍，实现了1的规模化生产。
关键词：安丝菌素P-3；珍贵橙色束丝放线菌；发酵工艺
以下为文章节选
安丝菌素P-3(1)是由珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnemapretiosum)产生的具有阻止微管蛋白装配成有功能的微管的细胞毒产物，在临床上可以作为弹头与不同的单克隆抗体连接，用于治疗肿瘤[1—2]。因其在临床上具有良好的应用前景，文献报道了不同方法提高1产量，如应用响应面分析优化碳源以增加A.pretiosum产1的产量[3—5]；采用13C示踪试验，监测并分析发酵过程中中心碳通量分布，然后通过调节磷酸戊糖途径，使1的产量提高到mg/L[6]。李婷兰等通过添加支链氨基酸成功调节了1与其结构类似物的比例[7]。Zhao等通
过对参与1合成的甲基丙二酸单酰辅酶A代谢途径中的2个关键酶基因的研究[8]，将编码甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因asm失活，同时过表达编码丙酰辅酶A羧化酶的基因asm，提高1的产量。Li等则采用过表达asm18基因来增加1的产量，并提高其结构类似物的多样性[9]。
虽然近年来对A.pretiosum的研究报道较多，但是1的产量尚没有得到大的提高，也没有应用于工业化生产。本研究在对1摇瓶发酵工艺优化的基础上[10]，选取经过UV诱变筛得的高产菌株SIPI-U-76，进行了5L发酵罐小试工艺的研究。通过对发酵罐工艺的调整优化，提高1的发酵生产水平。并且将优化的小试工艺放大至L和L罐，实现了1发酵工艺的放大。
1仪器与材料
2方法与结果
2.1培养条件
2.1.1种子培养
2.1.2发酵培养
5L发酵罐培养：将摇瓶种子以10％的接种量转接至装液量为2L的5L发酵罐中，设定培养温度28℃，初始搅拌r/min，DO自控在30％以上(与转速关联)，通气量0.12m3/h。d2一次性添加终浓度为0.4％的异丁醇。发酵过程中定时取样，测定pH值、菌体生物量(PMV)及1的发酵单位。
L发酵罐培养：将种子液以10％的接种量转接至装液量为L的L发酵罐中，设定培养温度28℃，初始搅拌r/min，通气量8m3/h，罐压0.04MPa。d2一次性添加终浓度为0.5％的异丁醇。发酵过程中定时取样，测定pH值、PMV及1的发酵单位。
L发酵罐培养：将种子罐种子以10％的接种量转接至装液量为L的L发酵罐中，设定培养温度28℃，初始搅拌r/min，通气量20m3/h，罐压0.04MPa。d2一次性添加终浓度为0.5％的异丁醇。发酵过程中定时取样，测定pH值、PMV及1的发酵单位。
2.2测定方法
菌体生物量(PMV)的测定：取发酵液10ml，离心(×g)10min，测定离心后菌体体积，按下式计算PMV。
PMV/％=(发酵液总体积-上清液总体积)/发酵液总体积×％
1发酵单位测定：取发酵液1ml，用等体积95％乙醇超声浸泡30min，离心(10×g)5min，上清液经0.45μm滤膜过滤后用HPLC法测定1的发酵单位。
HPLC条件[10]：色谱柱HypersilC18柱(4.6mm×mm，5μm)；流动相甲醇∶水(75∶25)；流速0.8ml/min；柱温30℃；检测波长nm；进样量10μl。根据标准品浓度计算发酵液中1的含量。
2.35L发酵罐试验
2.3.1摇瓶发酵条件的应用
根据前期研究结果[10]，将A.pretiosum突变株SIPI-U-76进行摇瓶培养，1的发酵水平为mg/L。将此工艺应用于5L玻璃发酵罐，结果见图1A。可见1的发酵单位远低于摇瓶发酵单位，约h时发酵单位达到最高，仅23mg/L。取罐上的菌丝体和摇瓶菌丝体分别进行镜检，观察到发酵罐中的菌丝体严重断裂，而对照摇瓶中的菌丝体结成致密的网状结构。推测导致两者菌丝体形态差别的原因是发酵罐发酵时为了维持一定的溶氧，需要不断提高搅拌转速，过高的搅拌转速产生过大的剪切力，从而导致菌丝体断裂，影响1的发酵单位。
2.3.2控制搅拌转速
为降低发酵罐搅拌带来的剪切力，同时又保证发酵过程维持一定的溶氧水平，将搅拌转速控制在r/min以下，通过调节通气量维持5L发酵罐中DO30％，突变株的发酵培养过程见图1B。可见，通过对搅拌转速的控制，1的发酵单位得到一定提高，在发酵h时达到最大值(.7mg/L)。此外可见，PMV随着发酵时间的延长快速增加，在98h时达50％，与摇瓶对比增加了70％。据此推测，可能因发酵罐传质、溶氧等条件都比摇瓶好，培养基的营养成分被菌体消耗用来生长，而不是用来合成产物1。基于此，进一步试验尝试减少种子培养时间来降低发酵罐中的生物量，以提高1的发酵单位。
2.3.3缩短种子培养时间
将菌株SIPI-U-76的种子培养时间由原来的48h减少到40h，接种至5L发酵罐中进行培养，结果见图1C。可见，将种子培养时间降至40h之后，PMV明显降低，在h达到最大(35％)，随后进入一个平稳期。1的发酵单位提高显著，在发酵h时达到.1mg/L。
2.3.4降低碳源含量
除了减少种子培养时间来控制PMV，本研究还尝试采用减少发酵培养基中的碳源含量来控制生物量。将发酵培养基中的玉米淀粉含量由原来的30g/L降至20g/L，其他成分及含量均不变，结果见图1D。可见，PMV在发酵h时达到最大值(30％)，随后进入平稳期，h后菌体出现自溶，PMV开始下降。同时，1的发酵单位在发酵h时达到mg/L，与摇瓶发酵单位相当。
2.4L和L发酵罐生产
将优化后的5L罐发酵工艺放大到L和L罐上，结果见图2。在L罐上，将搅拌转速控制在r/min就可以将DO维持在30％以上，PMV在放罐时约30％，1的发酵单位可达mg/L。与L罐相比，L发酵罐放罐时1的发酵单位最高可达mg/L，表明本研究5L罐的小试工艺在放大后有较好的重现性。
3讨论
本研究在摇瓶发酵研究的基础上，将1的发酵工艺放大到5L玻璃发酵罐。通过控制搅拌转速、调整通气量、缩短种子培养时间以及降低发酵培养基碳源含量等一系列调控措施，使1在5L发酵罐中的发酵单位得到大幅提高，并有效控制发酵罐中的PMV。随后将优化后的发酵罐工艺进一步在L和L罐上进行放大，1的发酵单位达到和mg/L，与摇瓶发酵的发酵单位(mg/L)接近[10]，较未优化的5L发酵罐中1的发酵单位(23mg/L)提高了11.5倍和12.8倍，实现了1发酵工艺的放大。
作者简介：沈晓放(—)，女，助理研究员，从事微生物与生化药学研究。
通信联系人：陈少欣(—)，男，研究员，从事微生物与生化药学研究。
Tel：-
E-mail：sxzlb
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