ZK作者/伯格
编辑/ZK主创们
引言生物药物是指利用生物体、生物组织、细胞或其成分等材料，综合应用生物学、医学、化学和工程学以及药学的原理与方法研制而成的一大类用于预防、治疗和康复保健的医用制品。
从更为广义的角度来定义生物药物它包括以下几类：
1、天然生物药物，例如：生化药物、微生物药物和海洋药物；
2、基因重组多肽和蛋白质药物；（同时包括基因工程和蛋白质工程药物）
3、基因药物，既指以遗传物质DNA、RNA及核苷酸衍生物为基础研制而成的基因治疗剂；
4、合成与部分合成的生物药物。
总的来说生物制药，就是把生物工程技术运用到药物制造领域，以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织为起始原料，采用生物学工艺及分离纯化技术制造出新的生物药品。
生物制药的基本过程概述尽管提供生物药物的生物资源包括动物、植物、海洋生物和微生物组织、器官、细胞与代谢产物，但应用微生物发酵与动植物细胞培养技术是目前获得生物药物的主要途径。
利用微生物发酵（传统的发酵工艺），。
生产生物药物的工艺中，通常将其分为菌种、发酵、提取、纯化四个阶段，同时会形成与之对应的四个生产岗位。
菌种岗位负责菌种的保藏、转接、培养工作，为发酵提供足量、合格的菌种；
发酵岗位进步扩大培养规模，并通过培养条件的控制使微生物进行代谢产物(目的物)的生产;
提取岗位根据目的物与培养体系中的其他成分在物理、化学、或生物学特性上的区别将目的物从复杂的生物体系中转移到特定的人工液相体系中(通常是水、缓冲液、稀盐溶液或有机溶剂等)；
纯化岗位通过更精细、更有针对性的方法或技术将提取液中的目的物与其他成分分离开来，从而提高目的物的纯度，使之达到一定的质量标准。
生物制药过程中共性问题相关讨论一、菌种岗位
培养基为菌种生长所需营养的基质。培养基要具备四个条件:
①含有所培养的菌株生长所需要的各种营养物质，如糖类、有机氮、矿物质等;
②所含养分浓度和状态要利于该菌种的吸收和利用;
③要有适宜的酸碱度;
④须经过严格灭菌，保持无菌状态。
同时第四点是通过灭菌才能达到的，但灭菌的高温会破坏培养基中的许多化学成分，并降低培养基的PH值，这一点必须在配制时就考虑到。这就要求尽量选用热稳定状态好的原料，灭菌前的pH值要略高于使用时所需的适宜酸碱度。
在菌种保藏和扩大培养过程中要注意:
①根据菌株对人和动物的致病力、毒性流行传染的危害程度，要实行严格安全的保藏管理制度;
②所有与菌种有关联的工作，如菌种的接受.检查和保藏等工作都应有专门的微生物分析员处理和控制，建立进出账目填写菌种记录，记录内容包括:菌种名称、编号、来源、形态特征、培养特性、生化检定、传代次数、最适培养基和培养条件、保藏方法、储存条件及保存库址等；
③菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名称，系列号、传代次数、接种时间等等，一旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必处理掉，处理过程应记录；
④制作或盛装培养基的器皿不能使用前应做无菌检查，以免铁锈或铜锈混入培养基中，使铁或铜含量过高；
⑤制成培养基在使用前应做无菌检查，方法是将其置于37℃左右的恒温培养箱内培养24小时:；
⑥不要使用培养基已经干编或老化的一级种，以免能响菌种存活率或导致生产性状退化；
⑦长期保藏的菌种用前应放在恒温培养箱中活化培养，并逐步提高培养温度，活化时间一般为1-3天；
⑧如在冰箱中保存时间间超过3个月，最好转管培养一次再用，以提高接种成功率和菌种生长速度；
⑨启用保藏的.级种，应认真检查是否有污染现象，被污染的菌种绝对不能用于扩大生产；
⑩制备好的培养基应及时用完，不宜久存，以免降低其营养价值或成分上发生变化；
?制备过程中一定要遵守无菌操作规程，并标好标签，注明菌种名称、接种日期和转接管次数，尤其在同一时间几种不同的菌种接种时，一定要严防混杂:；
?一级种转管的次数不能过多，一般以5-6次为好不能超过10次，否则由于移植时所造成的机械损失及培养条件的变化，会削弱菌种活力，导致遗传性状变异，因此引进或育成的菌种在第一次转管时，可较多数量扩转并以不同方法保藏，按计划使用；
?接种必须在洁净室进行，环境洁净度C级下局部A级的单向流空气区域内全过程必须无菌操作，防止微生物污染。
在生产过程中有时会出现菌种接种后不能生长的现象，其原因可能是
①菌种在保藏过程中已冻死或失去活力;
②菌龄过老，生活力衰弱;
③接种操作时，母种被接种铲(或接种环，接种针)或酒精灯火焰烫死;
④母种没有贴近培养基，菌种萌发后因缺少营养而死亡等
二、发酵岗位
发酵岗位最常见，也最严重的问题是染菌。发酵生产过程中污染生产菌株以外的菌称为杂菌。
发酵染菌主要污染细菌，包括球菌、杆菌、芽孢杆菌，此外还有放线菌、霉菌、酵母菌和病毒(主要是噬菌体)等。
1.发酵染菌的原因
发酵污染杂菌的原因错综复杂，但总体上说来分为以下几种
①设备渗漏，如冷却蛇管渗漏易污染水中的微生物，阀门或连接处罐体渗漏会污染空气中的微生物。
②无菌空气系统过滤失效或减效。当无菌空气系统过滤失效或减效时，易污染大量积于过滤介质上的霉菌、酵母菌和细菌。
③培养基灭菌不彻底。原材料中混有大量杂菌，灭菌不彻底很容易造成发酵过程污染。
④罐体及管道灭菌不彻底，由此造成大量隐藏于死角中的杂菌，尤其是芽孢杆菌未能灭活，导致发酵污染。
⑤种子系统带菌至下一代。种子染菌的原因有操作失误、环境不洁净和用品灭菌不彻底等三个方面，种子接种到发酵罐后其夹带的杂菌也随之进人发酵罐，造成污染。
⑥蒸气质量不好。蒸气不饱和或过饱和，前者热量低穿透力差，后者热量虽高但穿透力差，都会导致灭菌不彻底而容易染菌。
⑦补料系统不完善。有的工厂一根补料管道兼管所有发酵的补料，物料和管道灭菌不彻底常导致染菌；管道消毒后间隔时间太长、在管道灭菌后未用蒸气保压或者掉零后继续照常补料也会造成染菌；补料人键管道的小排气阀没有及时检修、垫漏沙眼等，在补料过程中补料液的流速很大，就有可能将空气中的杂菌经由小排气阀的漏点处抽人罐内造成染菌。
⑧人为因素。缺乏工作责任心操作质量差，也是发酵染菌的重要因素，如消毒工没有严格按照工艺规程操作，看罐工泡沫控制不好，造成顶罐逃液，都容易导致染菌。
⑨防染制度、防染措施不健全不完善，从而导致染菌。
2.无菌检验
在生产过程中，为了及早发现染菌并恰当处理，保证生产正常进行，对菌种制备、种子罐、发酵罐的接种前后和培养过程中须按工艺规程要求定时取样，以进行无菌检验。培养液是否污染杂菌可从无菌试验、培养液的显微镜拉查、培养液的生化指标变化情况等三个方面进行分析，无菌试验是判断染菌的主要依据。
现在采用的无菌试验方法有肉汤培养法、双碟培养法、斜面培养法等，其中以酚红肉汤培养法和双碟培养法结合起来进行无菌检查用得较多。
①肉汤培养法该法直接用装有酚红肉汤的无菌试管取样，然后放人37℃恒温室(箱)内培养。定时观察试管内肉汤培养基的颜色变化，同时进行显微镜观察。
②斜面培养法先用空白无菌试管取样，然后在无菌条件下接种于斜面培养业上，置于37℃恒温室(箱)内培养，定时观察有无杂菌菌落生长。
③双碟培养法种子罐样品先取人肉汤培养基中，然后在无菌条件下在双碟培养基上面划线，剩下的肉汤培养物在恒温室(箱)内培养6小时后复划线一次，发酵罐培养液直接取入空白无菌试管中，于37℃下培养6小时后在双碟培养基上划线。24小时内的双碟定时在灯光下检查有无杂菌生长。24~48小时的双碟一天检查一次，以防生长缓慢的杂菌漏检。在正常生产过程中，种子罐和发酵罐每隔8小时取样一次，进行无菌检查。该方法经常用于单菌落挑选，可以从染有杂菌的培养液中经多次划线挑取单菌落进行分离培养，以得到纯种的种子。
无菌试验的结果一般需要8~12小时才能判断。为了缩短判断时间，有时向培养基中加人赤霉素、对氨基苯甲酸等生长激素以促进杂菌生长。
染菌的判断方法一般以无菌试验中的酚红肉汤培养和双碟培养的反应为主，以镜检为辅。每个无菌样品的无菌试验至少用两只酚红肉汤或斜面同时取样培养。要定量取样，因取样量不同，影响颜色反应和浑浊程度观察。
如果连续3个时间的酚红肉汤无菌样颜色变化或变浑浊，或斜面连续3个时间样品长出杂菌即判断为染菌。有时酚红肉汤反应不明显，要结合镜检确认连续3个时间样品染菌，即判为染菌。各级种子罐的染菌判断亦参照上述规定。
3.染菌原因分析
查找发酵染菌的原因，以防再次发生，是生物制药过程中必须解决的问题。一般从以下几个方面着手。
①从染菌的范围来分析单罐染菌应从单体设备的清洁和灭菌操作上找原因，相同时间内同时出现几个发酵罐染菌应该从空气系统、补料系统、排气系统找原因。单罐连续或间断染菌应从该罐的清洁状况、试漏、死角或设备不合理方面找原因。
②从染菌的时间来分析尚未补加料之前发生的前期染菌，-般染菌量大，应从物料灭菌不透、种子带菌、泡沫顶罐、轴封渗漏等方面找原因，发酵的中后期染菌应从设备严密、空气系统、补料系统及中间工艺控制上找原因。
③从染菌的菌型来分析染酵母菌、霉菌由于不耐热，可从无菌室的清洁情况，倒瓶，并瓶时菌落数及设备泄露上找原因。染球菌、杆菌等不抗热杂菌应从空气过滤介质的破损失效、设备渗漏、培养基倒流等方面找原因。染芽孢杆菌等抗热杂菌时应从设备备的死角、罐内的清洁、不合理的设备装置及灭菌操作上找原因。
4、发酵染菌的处理
发酵罐污染杂菌后，应依据染菌时间、所染杂菌的危害程度及时进行处理，同时对所涉及的设备及时处理。
①种子罐染菌处理种子罐发生染菌后，不能往下道工序移种，应当及时用高
压蒸气直接灭菌，再过滤处理后放人下水道。
②发酵罐染菌处理发酵罐前期染菌，若污染的杂菌对产生菌的危害大，采用灭菌经过滤处理后放掉;如果危害不大，可用重新灭菌、重新接种的方式处理；如营养成分消耗较多，可放掉部分培养液补入部分新培养基后进行灭菌，重新接种；如污染的杂菌量少且生长缓慢，可以继续运转下去，但要时刻注意杂菌数量和代谢的变化。
发酵的中后期染菌，是加人适量的杀菌剂，如呋哺西林或某些抗生素，抑制杂菌生长；二是降低培养温度或控制补料量来控制杂菌的生长速度。如果采用上述两种措施仍不见效，就要考虑提前放罐。
③染菌后的设备处理，染菌后的罐体用甲醛等化学物质处理，再用蒸气灭菌，各种附属设备应同时灭菌，以消灭罐内设备附件死角中残留的杂菌。可通人罐容积万分之一的甲醛加少量水，进蒸气加热至℃排汽10min，再自然熏消30min，清洗干净，等待空消。在再次投料之前，还要彻底清洗罐体、附件，同时进行设备严密程度检查，以防渗漏。
由于细菌芽孢对温度的抵抗力大，故发酵罐染杆菌后不易杀灭，在罐垢层中的芽孢杆菌更不易溶出杀灭。处理方法:加入稀碱水浸煮，将芽孢杆菌从垢层中溶出，然后再用高压蒸气灭菌。
④污染噬菌体处理抗生素等产品在发酵过程中有时出现噬菌体污染，轻者造成生产能力大幅度下降，重者停产。一般噬菌体污染后往往出现发酵液突然转稀，泡沫增多，早期镜检发现菌体染色不均匀，在较短时间内菌体大量自溶，最后仅残留菌丝断片，平皿培养出现典型的噬菌斑，溶氧浓度回升提前，营养成分很少消耗，产物合成停止等现象。如果污染温和噬菌体时，其反应温和，平皿培养不出现明显的噬菌斑，只出现部分菌体自溶，生化指标变化不显著，生产能力降低，对生产的危害亦是严重的，但不易被发现。
发酵过程中污染噬菌体后，一般按如下方法处理
①种子室、化验室的接触用具一律用消毒液浸泡灭菌;
②发酵液用蒸气加热至℃~℃，维持30~45min,必须经高压蒸气灭菌后才可放掉，严防发酵液任意流失，以免扩大污染;
③放罐后的罐体设备经清洗后还应该用甲醛熏罐灭菌;
④全部停产，有关的管道和下水道及厂房环境区用甲醛和漂白粉喷洒消毒,以对环境进行全面的清洗和消毒，断绝噬菌体的寄生基础;
⑤更换生产菌种，不断筛选抗噬菌体菌种，防止噬菌体重复污染。
三、提取岗位
生物制药的提取工艺、设备因品种不同面有很大的差异，因而在生产过程中容易出现的问题各不相同，但因这类药物都来源于生物材料，故而也存在的共性问题。
生物药物稳定状态受p阳值、温度、离子强度、提取过程所使用的溶剂和表面活性剂剂、金属离子等方面的影响；生物药物，特别是大分子药物，对剪切力也很敏感，对分子质量越大，稳定状态越差；生物材料在提取、纯化过程中，其有效成分的生理活性处于不断变化之中，因此，在整个制造过程中，都要把防止目的物失活放在首位。
例：由于青霉素的水溶液不稳定，容易分解或异构化:青霉素本身不耐高温，在常温下也易降解;青霉素在碱性条件下不稳定，容易加速水解，因而在其提取和和精制过程中要遵循“时间短"、“温度低”、“PH值”合适这三个原则，如：发酵液应冷至10℃以下再预处理，预处理过程中PH值只能控制在4.8-5.2，且必须快速操作。
四、纯化岗位
生物制药的产品很多为非最终灭菌的无菌原料药，尽管纯化结束后有无菌过滤的操作，纯化过程中也必须尽量保护暴露产品、保护产品接触表面免受微生物污染，以降低产品的微生物负荷。
通常该污染来自人员、表面或工艺环境，所以纯化岗位的人员、设备、包装材料、生产环境的清洁过程必须严格执行操作规程，以保证微生物限度在除菌过滤器的无菌保证之内。
防止目的物失活也是纯化过程的面临的重要问题，尽管纯化所用方法相对于提取来说通常更温和，但PH值、温度、离子强度、金属离子等因素依然影响到目的物的话性，必须按工艺规程的要求严格执行。
在纯化精制过程中，尤其是后期，目的物的纯度越来越高，特别要注意减少产品的损失。产品的损失来源于器皿吸附、样品液体残留、空气氧化，甚至操作人员不慎等，必须通过完善工艺、规范操作、强化管理来尽量避免。
References:
[1]《药品质量生产管理规范》修订版
[2]《生物制药工厂工艺设计》
[3]《药品车间实训教程》
「专业研讨」生物制药基本工艺过程中产生的共性问题到这里就结束了，记得戳戳好看哦！
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