本周实验回顾
一、酵母菌形态的观察
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实验目的
（1）掌握目镜测微尺的校准方法。
（2）了解血球计数板的构造和计数原理。
（3）学习显微镜测微尺测定微生物细胞大小。
（4）观察并识别微生物的营养细胞的形态。
（5）区别酵母菌死活细胞。
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实验原理
单细胞真菌，细胞圆形、椭圆形或圆柱形，有明显细胞核、脂肪粒等内含物，繁殖方式以芽殖为主，还可产生有性子囊孢子。
美蓝是一种无毒的染料，氧化型呈蓝色，还原型为无色，用美蓝对酵母进行染色时，由于活细胞细胞内由于脱氢具较强还原能，使美蓝由蓝色氧化型变为无色还原型。
因此，活酵母细胞是无色，而死细胞呈蓝色或淡蓝色，活性越强细胞褪色时间越短，可鉴别酵母菌活细胞和死细胞。
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实验材料
（1）菌种：酿酒酵母
(2)器材载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、吸管、镊子，显微镜等。
(3)染色液;碘液和吕氏碱性美蓝染色液(0.1%)
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方法和内容
(1)在干净的载玻片上，加一滴碘液，按无菌操作用接种环取少量菌体，放在染色液中轻轻混匀，盖上盖玻片(不要产生气泡)，在显微镜下注意其细胞形状、大小、芽殖。
(2)载玻片中央滴加1滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，无菌操作在斜面培养基挑取少许酵母菌与美蓝液混均匀用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖片放平，以免产生气泡放置2-3min后镜检(高倍)观察颜色变化，区别死活细胞。染色半小时后再观察一下死细胞数是否增加。
酵母菌形态观察图
酵母菌死活细胞观察图
二、微生物大小的测定
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实验目的
(1)掌握测微尺测定微生物大小的方法;
(2)了解目镜测微尺和镜台测微尺的原理;
(3)增强对微生物细胞大小的感性认识。
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实验原理
微生物细胞大小是微生物形态特征之一，也是分类鉴定依据之一。对于病毒、细菌、放线菌、真菌和原生动物等不同类型的微生物来说，大小存在很大的差异。在同一类型中不同种类的微生物或同一种类中不同时期微生物个体，大小也存在很大的差异。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将Imm等分为格，每格长0.01mm(即10um),用于校正且镜测微尺每格相对长度。
目镜测微尺是一块中央有精确等分刻度的圆形小玻片，置于接自镜中隔板上。目镜测微尺每小格所代表的实际长度不一样，测量前，必须先用镜台测微尺进行校正。
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实验材料
(1)菌种:酿酒酵母
(2)器材:显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺
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实验步骤
(1)装目镜测微尺
取出接目镜，把目镜上的透镜片旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。(2)放镜台测微尺将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。
（3）校正目镜测微尺
先低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度部分移至视野中央，调节焦距，当清晰看到镜台测微尺刻度后，转动目镜，使目镜测微尺刻度与镜台测微尺刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占格数。
(4)计算由于已知镜台测微尺每格长10μm，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。
目镜测微尺每格长度=两重合线间镜台测微尺分数x10/两重合线间目镜测微尺格数
（5）菌体大小测定
测定酵母菌时，先将培养物制成水浸片，然后用高倍镜测出宽和长各占目镜微尺格数。最后，将测得格数乘上目镜微尺（用高倍镜或油镜时）每格所代表长度，即为酵母菌实际大小（注意：可选择有代表性的3~5个细胞进行测定；细菌的大小需用油镜测定，以减少误差）
酵母菌测量结果（仅供参考）
菌体编号平均
宽度μm
长度.3μm
三、微生物数量的测定
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实验目的
（1）明确血细胞计数板计数的原理
（2）掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
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实验原理
显微镜直接计数法是将少量待测样品悬浮液置于一种特别具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
直接计数法优缺点：优点：直观、快速、操作简单。
缺点：不能区分死菌与活菌，所得为总数；不适于对运动细菌的计数。
血球计数板计数原理：
一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中间较宽的平台又被一段横槽隔成两半，每一边平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分9个大方格，中间大方格即为计数室。
两种规格，（1）一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16小方格；（2）一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格计数板，每一个大方格中小方格都是个。
以25个中方格的计数板为例，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：
1mL菌液中的总菌数=A/5×25×B×10^4
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实验材料
(1)菌种：酿酒酵母
(2)器材：显微镜、血球计数板
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方法和内容
实验步骤
（1）镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。
（2）加样品
将清洁干燥血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液（注意：要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生）
（3）显微镜计数
5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。
在对酵母菌菌悬液进行计数时，第一次我们观察到每格中的菌数过多，应该控制在5—10/小格。
注意：对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。
对于压线酵母，按照数上不数下、数左不数右的原则计数。
（4）清洗血细胞计数板
完毕后，将血细胞计数板在水龙头下用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干，镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
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