真菌（Fungus）一词的“拉丁文”Fungus（fungi）原意是蘑菇，是一种真核生物。真菌的细胞上有含甲壳素（又叫几丁质、甲壳素、壳多糖）为主要成分的细胞壁，和植物的细胞壁主要是由纤维素组成的不同。
近二十年来，人类真菌感染的发病率逐年增加，医院内感染致病菌的第六位，在排名前十的致病菌中，真菌感染死亡率最高。由真菌所引起的感染日益成为临床各科室面临的巨大挑战。能否准确诊断是否真菌感染，临床在选择合适的治疗方案时非常重要。
上海公共卫生临床中心钱雪琴
真菌病原学检测入门（上）主讲人：钱雪琴真菌病原学检测入门（中）主讲人：钱雪琴真菌病原学检测入门（下）主讲人：钱雪琴（马上点击图片了解）
1、能否请老师再详细谈谈菌丝阻断的具体操作方法和作用?
答：菌丝阻断的目的是刺激产孢，阻断营养菌丝的疯长。可以在菌落上用刀片切割数刀，要求切割至培养基下。
2、钱老师,您们的PDA琼脂粉和察氏培养基的琼脂粉都是那里买到的呀?梅里埃公司居然没有的.
答：国产应该有，比如说杭州天和，进口的有OXOID和BBL公司的。实在不行上万能的淘宝网吧，价格不是很贵的。
3、"呼吸道墨汁负染色:加生理盐水震荡后,自然沉淀取上清液涂片",老师请问为什么不取沉淀物涂片呢?隐球菌不会沉底吗?
答：用生理盐水震荡的的目的就是因为脓痰太浓了，直接墨汁染色不能完全渗透标本，所以用盐水震荡洗涤把痰里面可能存在的隐球菌洗脱出来，如果继续用沉淀物涂片染色，那盐水震荡洗涤就没有意义了。当然，肯定有一部分隐球菌会沉底，但只要静止的时间不要太久就好了。
4、察氏培养基在哪买的
答：请看第2题回答。
5、请问老师:皮炎芽生菌在组织中能看到菌丝吗?与隠球菌的区别?
答：皮炎芽生菌是双相型真菌，在组织里是呈现酵母相，看不到菌丝的。皮炎芽生菌的芽生是“宽基底芽生”，没有荚膜。而隐球菌在组织内芽生孢子是芽颈细，并且有宽厚的荚膜。
6、请问钱老师什么情况下需要做小培养？
答：因为小培养能够连续观察，可以清楚的看到真菌的结构及生长发育情况，如产孢方式。一些很容易脱离的孢子链、孢子的原始排列顺序在小培养时都可以完整的保留。
7、请老师详细讲讲小培养的具体操作方法,谢谢
以上是方块法做的小培养，小培养还有玻片法和钢圈法，具体的操作可以看看相应的参考书，或随后我们推出的视频。
8、基层实验室对真菌如何处理？
答：还是要有二级生物安全的实验室才能开展相应的真菌标本的处理，最好是独立的实验室区域。如果条件暂时不具备而又分离出丝状真菌，医院或第三方检验机构。一定要在保证生物安全的条件下开展工作。
9、钱老师,丝状真菌把培养基上的菌落划破诱导产孢是什么原理?
答：切断营养菌丝的疯长，刺激产孢。
10、钱老师能拍个小培养操作视频吗
答：正在拍摄处过理，过一段会传上来。
11、感谢钱老师,想问下真菌培养出来后做不染色镜检,如果用透明胶带法需要加生理盐水吗?
答：需要的。
12、药敏雷同,医院做起来就没什么意义了?血平板长否?是不是被其他细菌抑制得狠严重?
答：真菌的耐药性比较稳定，不会像细菌那样很容易有获得性耐药，但不同的真菌菌种之间对抗真菌药有时还是有一些区别的，所以对真菌而言，准确鉴定出菌种比药敏更为重要。但临床上还是有耐药株的产生，还有就是临床上分离的新发菌株，还是有必要做药敏数据的。由于真菌生长的特性，血平板不是真菌的最适的培养基，真菌在血平板上不能完全的表现出自己特有的菌落形态、颜色、菌丝的形态、产孢方式等，最后还得转SDA、PDA上以进一步鉴定。
13、丝状真菌的分布有无地域性？
答：真菌有地域性的，比如马尔尼菲在南方多见，孢子丝菌北方多见，粗球孢子菌、副球孢子菌在美洲多见，但随着我国的出国的旅游热、挖矿热、淘金热，一些输入性的真菌也在我国出来了。真菌的地域性分布，和真菌的自然宿主分布有关。
14、老师镰刀菌菌落中心有黑色颗粒吗?前阵子我们有个镰刀菌就有黑色颗粒.是我们报错了?
答：部分镰刀菌可以产生子囊壳，在菌落上呈现不同颜色类似颗粒状物质。不知您有没有采集该黑色颗粒染色看看
15、钱老师,非无菌部位的标本真菌培养阳性只报菌名,不做药敏是吗？这样临床会问要药敏结果的,怎么跟医生解析?
答：大部分来自非无菌部位的标本真菌培养阳性确实只需要报菌名，无须药敏，如果确认该真菌为致病菌，需要治疗，可以参照热病或其他相关的抗感染学书本的介绍。酵母菌、隐球菌、曲霉还是有药敏标准的，如果条件允许，可以参照相关的试剂盒说明书操作。
16、临床实验室如何判断真菌是否为污染?一般实验室培养出毛霉之类不允许再打开培养基,那如何再分类?请钱老师做一个小培养的视频.便于我们学习
答：是否能够重复分离出、是否能够与涂片结果相符、是否与临床症状相符、是否与其他的检查相符（如影像学、血清学）。毛霉在生物安全柜内，还是可以开盖的，用“L”型接种针勾一点菌丝孢子，染色观察以便鉴定。小培养的视频做好了，正在剪辑中。
17、小培养如何在基层实验室执行,有什么条件限制？
答：小培养？如何在基层实验室执行，有什么条件限制？
18、钱老师,真菌培养出最终报告时,病人都已出院了,怎么处理？
答：继续报告，让临床完整病历。如果病人转出院了，分离出有意义的真菌，对疾病诊断和治疗有重要指导意义，应当联系病患者，提供相应的后续服务。
19、丝状菌在我们基层分离鉴定会不会被污染实验室？
答：如果不按规范操作，丝状真菌的孢子还是会漫天飞舞的，污染的可能还是会存在的，但幸好绝大部分丝状真菌是二级生物安全真菌，危害性不是很大。如果规范操作，丝状真菌的培养和鉴定还是安全的。
20、医院实验室都只报了有真菌生长和无真菌生长,临床经验用药,因为药不多就没做药敏,也有很多污染的毛霉不好报,培养时间长和培养基容易过期都是问题,请问什么情况是必须做鉴定和药敏的
答：来自于无菌部位的标本，严格意义上都应该鉴定到种。来自非无菌部位的标本分离出丝状真菌，如果临床症状高度怀疑真菌感染，应该进行鉴定。隐球菌是可以做药敏。
21、请问下呼吸道标本涂片找新型隐球菌具体怎么做法,有没有夹膜?
答：墨汁染色查荚膜，如果脓痰可以预先消化，或生理盐水震荡洗脱后取上清液再行墨汁染色。
22、丝状真菌鉴定除了看菌落和镜检,不典型的真菌还做生化反应吗?实际操作中如何更好的做好生物安全防护?谢谢！
答：有些真菌还是可以做一些生化反应的，离蠕孢和德氏霉可用芽管试验区别，皮肤癣菌的尿素实验，组织胞浆菌的尿素试验等，但实际工作中很少使用。绝大部分的丝状真菌检测鉴定按二级生物安全防护就可以了，外排的生物安全柜，口罩、帽子、后开襟的防护服就好了。
23、请问老师,真菌的操作过程中的生物安全防护问题
答：二级生物安全防护就好了。生物安全柜内涂片、染色。
24、我们真菌一般是37度培养,那培养出来怎么后怎么区分是双向菌呢？
答：我们一般是接种两份真菌培养基，一份置于35度培养（非37度），一份28度培养，如果都置于35度培养，部分真菌是不长的。要区分双相型，转种两份培养基（每一份都包含SDA、PDA、血平板），分别置于28度和35度培养。
25、想问一下平时真菌培养与细菌培养申请单是否要分开开具,费用？
答：分开和捆绑都可以，收费按省物价局的标准。
26、钱老师,丝状真菌长时间培养菌落中会有液体渗出,比如一种青霉菌,还有枝顶孢,这是怎么回事？
答：真菌培养一定时间后会产生粘液珠、颗粒、色素等，这是真菌的一种特征。
27、请问老师们,真菌培养瓶梅里埃的有卖吗,与BD的比较,还有那家的真菌培养瓶还好？
答：可以咨询梅里埃公司。
28、有一种丝状真菌打开平板后很快从白色变成橙色,是什么啊
答：有的真菌产色素需要光照刺激，比如暗色真菌。有一种青霉在光照后可由白色变为橙色。
29、双相真菌培养需要多长时间？
答：不同真菌，需要的时间不同，比如马尔尼菲1周内即可，而组织胞浆菌，临床上常常延长培养到6周。
30、可以分享一下临床常见真菌通常在空环境中的什么地方出现吗？
答：土壤、空气中常见。比如春季湿度大时，在墙角就可以见到大量的真菌生长。
31、皮屑查找菌丝有什么好的方法?
答：直接用KOH透明，为了加快速度，可以在酒精灯上微微加热
32、甲真菌病指甲用什么培养基,用PDA或SDA可以吗?
答：完全可以，临床上一般就接种SDA，根据分离的菌落大致形态，选择转种分离到PDA或脑心浸液平板上。
33、我们二级实验室在面对三天发报告,是否适合开展这方面的真菌培养,需要准备什么?
答：根据临床需要，在二级实验室可以开展真菌培养的。
34、请问角膜怎么规范采样,我们眼科经常怀疑真菌感染,但是我们做不出来,我们只有SDA,除了培养基的影响,我想标本采集也很重要
答：是的，标本采集非常重要，最好床旁接种，由临床医生自己接种。
35、皮肤和指甲真菌感染直接镜检方法上有什么技巧,我们尝试用透明胶带+乳酸酚棉兰法或者生理盐水涂片感觉效果不好,菌丝孢子不好找。
答：用KOH透明后就非常好看了，菌丝非常清晰，一般无须染色的
36、呼吸道标本涂片找新型隐球菌有没有夹膜
答：有荚膜
37、真菌培养时间太长,会不会有假阳性？
答：当然有，所以在观察平板时要注意防止污染。
38、对于分离到的丝状真菌,哪些是可以直接判断为致病真菌,哪些是可能为污染性真菌需要与临床沟通
答：来自无菌部位的标本，都要考虑为可能是致病菌，都要与临床沟通的。分离的条件致病菌一定要和临床沟通。
39、涂片和染色必须在负压实验室安全柜里做吗？
答：按微生物实验室生物安全规范，这些操作是要在生物安全柜内进行。
40、请问老师:丝状真菌药敏怎么做？
答：按CLSI-M38-A2丝状真菌药敏肉汤稀释法。
41、请问老师们,是否有文件要求:必须有专门的真菌实验室才能开展真菌培养这个检验项目?我院没有真菌实验室,故没敢开展.老师们的情况又是怎样的呢?高手老师们那里是不是都有真菌培养申请单?
答：只要符合二级生物安全要求的实验室就可以开展一般的临床真菌的培养鉴定了，独立的区域，配备外排二级生物安全柜是必须的。当然除了硬件外，人才与真菌知识的储备同为重要。
42、中国不是荚膜组织胞浆菌的流行区域吧？
答：中国不是荚膜组织胞浆菌的流行区域，据文献报导，在北美洲部分区域流行。但随着人口的流动，已呈世界性的分布了。
43、请问老师们,我们现在有一个诊断为耶肺的病人,HIV阴性,但疑似血中有马内菲生长,这是什么情况?老师们碰到过吗?
答：这种情况还是可以见到的，虽然马尔尼菲青霉80%多是自HIV阳性患者中分离出，但还有少部分是来自HIV阴性患者，如移植患者、白血病患者、重症免疫抑制患者等。
44、临床考虑真菌感染,如何经验用药？
答：不同的真菌、不同部位感染，经验性用药还是不尽相同，可以看看热病或汪复教授编写的相关书籍。
45、请问老师墨汁染色,用什么墨汁好,另外浓度和时间？
答：最好的墨汁是印度墨汁，国产的一得阁墨汁也基本符合要求。一般墨汁用无菌蒸馏水稀释1-2倍，在低倍镜下能看到细沙状墨汁粒为佳。
46、白念ATCC或有纸片法的质控标准吗？
答：在CLSI-M44-A文件里有。
47、一般实验室培养出毛霉之类不允许再打开培养基,那如何再分类？
答：在生物安全柜内，还是可以开盖的，用“L”型接种真沟一点菌丝孢子，染色观察以便鉴定。
48、请问氢氧化钠也是10%的浓度吗？
答：没试过氢氧化钠。
49、钱老师,你们真菌培养7天出初步报告,是所有标本种类吗,最终报告培养多少天？
答：不同的标本，疑似真菌感染，会根据临床沟通的结果延长培养时间，一般我们会在7天出阴性报告，但会注明：标本继续培养，如果继续培养阳性，追加报告，以最后追加报告为准；如果继续培养阴性，不再追加阴性报告。
50、角膜接种啥平板？
答：临床医生角膜刮片，直接接种血培养，如果标本充裕，可以加种SDA和巧克力平板。
51、在痰标本处理镜下看隐球菌,请问钱老师用4%NaOH是否可以替代KOH?10%与20%的KOH有什么区别?20%的KOH消化组织?
答：痰标本用10%KOH，没试过4%的NaOH。如果皮质角化层越厚，KOH的浓度越高。如果是皮屑可以用10%KOH，如果是指甲、硬化的皮肤组织可以用20%KOH透明。
52、请问老师培养出毛霉菌,临床一般多用哪些药物,谢谢！
答：最常用的是两性霉素B。
53、墨汁染色的墨汁有啥要求嘛?一般染多久效果更好?
答：没特殊要求，主要墨汁颗粒细小均匀就好，注意防止墨汁被污染。染色时间没严格的要求，墨汁染色后3-5分钟就可以观察了。
54、如果遇见毛霉菌怎么样做药敏呢？
答：临床上毛霉菌一般不需要做药敏的。如果需要药敏实验，可以看看CLSI相关文件。
55、眼科真菌培养让医生接是直接把标本放在平板内就可以了还是要划平板？
答：直接把标本涂抹在在平板内即可。
56、直接把标本涂抹在在平板内即可。
答：取材得当，KOH法检查菌丝在镜下还是很好看的。
57、请问哪些真菌是常见的污染菌?哪些致病的多呢?
答：常见的污染菌有青霉、链格孢、曲霉、枝孢霉、木霉、帚霉等。常见的致病菌有酵母菌、曲霉、毛霉、马尔尼菲青霉、隐球菌、镰刀菌等。
58、如果是角膜刮片医生怎么划?是用棉签划不是接种环?
答：由临床采样的医生用刮片在平板上划几道，至于分区划线由微生物室工作人员操作。
文章来源：微生物之家
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：真菌荧光染色液（一步法）
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：用于各种真菌染色
：真菌荧光染色液是一种含有KOH、荧光素和抑制背景荧光着色染料的复合溶液的新型染色液，能快速检测各种疑似真菌感染。试剂能与真菌细胞壁上β—多糖（如几丁质、纤维素等）非特异性结合，在荧光显微镜下可看到特定激发光下产生的荧光。有助于更清楚的观察真菌结构。临床运用如皮肤科的体股癣，手足癣，甲癣和花斑癣、头癣等的检查。
传统方法只能检测某些特定的真菌,而不能对所有的真菌进行检测,而该荧光染料能够与各类真菌结合而发出荧光，包含念珠菌属，组织胞浆菌属，曲霉菌属、毛癣菌属、小孢子菌属、表皮癣菌属等。真菌菌丝的不同发育阶段均可被荧光染色。此外，该款试剂盒还能检测出耶氏肺孢子虫囊肿，寄生物（例如疟原虫、阿米巴原虫），以及各类地域性变异真菌菌丝都能使用本试剂盒进行检测。角蛋白，胶原蛋白，弹性纤维也可以被染色。
：真菌荧光染色液（一步法）与传统KOH湿片法比较具有敏感性高、特异性高、阳性率高的特点。尤其是在KOH湿片法中的孢子和脂肪滴区别鉴定，荧光染色液不与脂肪滴着色，且屏蔽其他杂质，易于鉴别。真菌荧光染色液染色时间短，结果直观，与传统KOH湿片法相比较能大幅提高临床标本的真菌检出率。
：常温、避光；有限期2年（开瓶后90天）
：南京黎明生物制品有限公司
：彭经理
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