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高中生物学中的检验技术

1以同位素标记检验

1.1以18O来检验光合作用释放的氧气

20世纪30年代,美国科学家鲁宾(S.Ruben)和卡门(M.kamen)利用同位素标记法研究了光合作用释放的氧气,是来自水还是来自二氧化碳。他们用氧的同位素18O,分别标记H2O和CO2,使它们分别成为HO和C18O2,然后进行2组光合作用实验。第一组的绿色植物提供HO和C18O2,第二组向2种绿色植物提供HO和C18O2。在相同的条件下,他们对2种光合作用实验释放的氧进行分析,结构表明,第一组释放的氧全部来自18O2,第二组释放的氧气全部来自16O2。这个实验表明,光合作用释放的氧全部来自水的分解。

1.2以32P或35S来检验遗传物质

年赫尔希和蔡斯用大肠杆菌T2噬菌体作为实验材料,来证明DNA和蛋白质谁能够承当遗传物质。

他们首先在分别含有放射性同位素35S和放射性同位素32P的培养基中培养细菌。然后分别用上述细菌培养T2噬菌体,从而制备出DNA中含有32P或蛋白质中含有35S的噬菌体。接着他们分别用被32P或35S标记的T2噬菌体去感染未被标记的细菌,经过短时间的保温后,用搅拌器搅拌、离心,这时离心管的上清液中就会析出重量较轻的T2噬菌体颗粒,而离心管的沉淀物中则含有被感染的细菌。赫尔希和蔡斯发现,用35S标记的一组侵染实验,主要在上清液中检测到了放射性同位素,而用32P标记的一组实验,主要在试管的沉淀物中检测到了放射性。通过以35S标记的一组侵染实验,证明了蛋白质不是遗传物质,而以32P标记的一组实验,则证明了DNA是遗传物质。

此外还可以用放射性同位素15N(或14N)标记DNA分子,来检验DNA分子的复制方式等。

2以测交、自交或配子的性状检验

孟德尔用假设—演绎的方法,发现了基因的分离定律和基因的自由组合定律。而验证这两个定律的方法是测交或自交。

以基因的分离定律为例,先看测交:用纯合的高茎豌豆和矮茎豌豆杂交,产生的子一代的表现型是高茎,其基因型是Dd。让其与矮茎豌豆测交,产生的测交后代的表现型为高茎:矮茎=1:1,这说明了子一代在产生配子时,等位基因发生了分离,分别进入2个配子中,这2种类型的配子数量相等,D:d=1:1;而矮茎亲本只能产生一种类型的配子,即d,两性配子结合就产生了比例为1:1的测交后代。这一事实证明了基因分离定律的正确性。

再看自交:根据上述,子一代为杂合体,子一代自交即Dd×Dd,当进行减数分裂时,父本会产生2种类型的精子(D,d),母本也会产生2种类型的卵细胞(D,d),精子和卵细胞的数量相等,结合的机会也相等,因此产生的子二代的表现型为3高:1矮。通过子二代的表现型的性状分离比,说明了子一代杂合体(Dd)在减数分裂过程中的确发生了分离。从而也证明基因分离定律的正确性。

3以正反交的方式进行检验

正反交指两个不同基因型的杂交亲本在杂交时,配置父母本的两种方式。若以A、B两种不同基因型的亲本杂交时,若以A为母本,B为父本为正交,则以B为母本,A为父本的方式为反交。正交和反交是相对的。正反交的结果可能因遗传方式的不同会存在差异,在高中生物学中的正反交的主要作用是用来检验伴性遗传和细胞质遗传。

4以培养基进行检验

4.1以鉴别培养基检验

在培养基中加入某种指示剂或化学药品就可以用来鉴别不同种类的微生物。例如,在培养基中加入伊红和美篮,就可以用来鉴别饮水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。若存在大肠杆菌,其代谢产物(有机酸)就与伊红和美篮结合,使菌落呈现深紫色,并带有金属光泽。

4.2以选择培养基检验

选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,而促进所需要的微生物的生长。例如,当需要酵母菌和霉菌时,就可以在培养基中加入青霉素,用来抑制细菌、放线菌的生长。从而可以分离出酵母菌和霉菌。当然也可以在培养基中加入高浓度的盐水,来抑制细菌的生长。

5以化学染料进行检验

用化学染料可以检验植物的种子是否具有生命活力。例如用一定浓度的红色墨水来处理植物种子,若种子被着色,则说明该种子已经死亡,不能着色说明种子是有生命力的。

6以不同浓度的溶液进行检验

可以用不同浓度的溶液来检验植物细胞的质壁分离及其复原。人们通常采用洋葱表皮细胞为实验材料,来观察质壁分离及其复原现象。这可以通过使用不同浓度的蔗糖溶液(或其他溶液)来进行测定。通常用30%的蔗糖溶液就可以取得比较理想的效果,但如果蔗糖的浓度过大,比如达到50%,那么洋葱表皮细胞会迅速发生质壁分离,之后不能再复原,不能复原的洋葱表皮细胞说明已经死亡。

7以DNA探针进行检验

DNA探针具有多种检验功能,利用同位素标记的DNA探针探测样品中含有的特定的DNA序列,例如,对基因突变的镰形细胞贫血症进行分子诊断。

8以不同的颜色反应进行检验

高中生物学中牵涉到的颜色反应有:赤、橙、黄、绿、蓝、紫,通过不同的颜色反应,可以判断某种物质(或结构)的存在。

8.1斐林试剂验证还原性糖的存在

斐林试剂可以分为甲液和乙液,甲液是质量分数为0.1g/mL的NaOH溶液,乙液是质量分数为0.05g/mL的CuSO4溶液。

在使用时,甲液和乙液要混合均匀后再放入待检的组织样中,由于NaOH和CuSO4可以发生化学反应生成Cu(OH)2,因此斐林试剂的有效成分是Cu(OH)2。被检测的生物组织样液一般是采用白色的,应当避免用绿色的叶片及颜色较深的组织,以免干扰正常的颜色反应。当把斐林试剂放入组织样液后,还应当把试管放在50oC-60oC的水浴中加热,时间大约是2min左右,结果有砖红色的沉淀产生。其原理是(以葡萄糖为例):

CH2OH-(CHOH)4-CHO+2Cu(OH)2————CH2OH-(CHOH)4-COOH+Cu2O↓+2H2O

8.2吡罗红鉴别细胞中RNA的存在

进行实验的细胞可以用人的口腔上皮或者洋葱的鳞片叶内表皮。在实验时,往往是把吡罗红和甲基绿放在一起联合使用,来同时鉴定2种核酸的存在。

吡罗红甲基绿染色剂的甲液是:吡罗红甲基绿粉1g加入mL蒸馏水,乙液是:乙酸钠16.4g,加入蒸馏水0mL。实验时还要加入盐酸,因为盐酸可以改变细胞膜的通透性,能够使染色剂快速进入细胞,迫使DNA和蛋白质分离,这样有利于染色剂与DNA结合。

基本原理是:由于甲基绿和吡罗红对于DNA和RNA的亲和力有差别,甲基绿使DNA呈现绿色,吡罗红使RNA呈现红色。

8.3苏丹Ⅳ鉴定脂肪

苏丹Ⅳ是脂肪的染色剂,能够使脂肪染成红色。但是对糖类、蛋白质不起作用。

8.4革兰氏染色法鉴别细菌类型

运用革兰氏染色法可以使某些细菌染上红色,凡是被染上红色的细菌都是革兰氏阴性细菌。其原理是革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了复染液(番红)的颜色,因此呈现红色。

8.5用苏丹Ⅲ鉴定脂肪颗粒

将花生的子叶切成很薄的一片,放在载玻片上,向其上滴2-3滴苏丹Ⅲ染液,经过3min左右,再滴入1-2滴体积分数为50%的酒精溶液,制成临时装片,在高倍镜下看就可以看到若干个橙黄色的脂肪颗粒。

8.6以纸上层析法进行检验

通过一定方法获得的滤液,将滤液规范地划在事先用剪刀剪成矩形的定性滤纸的适当位置上,放入层析液中,经过一定时间后,就可以在定性滤纸的最上端(形态学)出现橙色,它是胡萝卜素,其扩散速度最快。

8.7以纸上层析法进行检验

在上述的纸上层析过程中,在定性滤纸上扩散的色素至上而下的第二条色素带的颜色是黄色,它是叶黄素,其扩散速度仅次于胡萝卜素。

8.8以革兰氏碘液进行检验

革兰氏碘液可以鉴定蛋白质。革兰氏碘液是由1g碘,2g碘化钾加蒸馏水mL制成。将碘和碘化钾先混合后,加入少许蒸馏水摇振待完全溶解后,再加入蒸馏水mL即可。用革兰氏碘液鉴定蛋白质的具体方法是:将蓖麻籽剥掉种皮后切成薄片,选择几片大的放入95%的酒精中,通过更换酒精的次数,溶解掉其中的脂肪。之后取出一片放在载玻片上,滴加1-2滴革兰氏碘液,制成临时装片。先使用低倍镜寻找到理想的部位,然后换上高倍镜,就可以在椭圆形的糊粉粒中观察到呈淡黄色的蛋白质晶体。

绿

8.9以纸上层析法进行检验

在上述的纸上层析过程中,在定性滤纸上扩散的色素至上而下的第三、第四条色素带的颜色分别是蓝绿色和黄绿色,它们依次是叶绿素a和叶绿素b,叶绿素a的色素带最宽,这与其含量有关。

8.10以甲基绿检验DNA的存在

前面已经有过表述,甲基绿可以使细胞核被着上绿色,主要是使细胞核中的DNA分子染成绿色,这里不再累赘。

8.11以健那绿检验线粒体的存在

健那绿是线粒体活体染色剂,它能将线粒体染成蓝绿色。健那绿染色剂的配制方法是:健那绿0.5g溶解于50mL的生理盐水中,加热在30oC-40oC之间,使健那绿充分地溶解。同样可以用人的口腔上皮做成临时装片:在洁净的载玻片中央滴一滴健那绿染液,再把人的口腔上皮细胞放入健那绿染液中,盖上盖玻片放在高倍镜下观察,就可以看到蓝绿色的线粒体。

8.12以二苯胺检验DNA的存在

DNA在氯化钠溶液中的溶解度随着氯化钠溶液浓度的变化而变化。当氯化钠溶液的浓度为0.14mol/L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理可以将溶解在氯化钠溶液中的DNA析出,并用二苯胺进行检验(产生蓝色为DNA标志)。

在实验室一般是采用对照的方法,在2支20mL的试管中各加入物质的量的浓度为0.mol/L的氯化钠溶液5mL,将通过前期实验获得的丝状物(含DNA)放入其中的一个试管,然后用玻璃棒搅动,使得丝状物充分地溶解。然后向2支试管各加入4mL的二苯胺试剂,混合均匀后将试管放入沸水中加热5min,经过冷却就可以观察到带有丝状物的试管呈现蓝色。

8.13革兰氏染液检验细菌

革兰氏染液能够使某些细菌染成蓝紫色,这类细菌属于革兰氏阳性细菌。基本原理是:细菌对革兰氏染色有不同反应,是由于两种细菌细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的,在染色过程中,当用乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,使其通透性降低,造成结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色,因此呈现蓝紫色。

8.14以鉴别培养基检验大肠杆菌的存在

此问题在3.1中已有说明。

8.15以双缩脲试剂检验蛋白质的存在

双缩脲试剂可与蛋白质反应,生成紫色的络合物,从而证明蛋白质的存在。

双缩脲试剂甲液为质量分数是0.1g/mL的NaOH溶液,双缩脲试剂乙液是质量分数是0.01g/mL的CuSO4溶液。

基本原理是:具有两个或两个以上的肽键(-CO-NH-)的化合物,都可以与双缩脲试剂反应,生成一种紫色的络合物。这种紫色的络合物是蛋白质的肽键在碱性溶液中与Cu2+形成的。这种颜色的深浅与蛋白质的浓度有关,蛋白质的浓度越大紫色就越明显。

9以免疫凝集反应的程度进行检验

以免疫凝集反应的程度可以检验异种生物之间的亲缘关系。血浆是血液的液体成分,当血液凝固后血块周围的透明的液体是血清,它与血浆的主要区别是不含纤维蛋白原。当异体蛋白进入某种动物(如家兔)内体时,就会刺激该动物使其产生抗体。抗体存在于血浆中其化学本质是蛋白质,具有较强的专一性。如果将人体的血清注入家兔的体内时,家兔体内就会产生抗体,与人的血清相拮抗。将人的与血清与家兔抗体混合后,就会发生%的凝集反应,产生沉淀。将其他动物的血清与这种家兔的抗体混合,若凝集反应越强烈,沉淀越多,则说明这种动物的血清与人的血清越相似,这种动物与人的亲缘关系就越近,反之就越远。

本文发表在《生物学教学》年第10期,67-69









































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