(3)毒力试验:取10只20 g体重的雄性小白鼠,5只每只腹腔内注入抗原液0.5 ml,另5只每只腹腔内注入生理盐水0.5 ml,喂养2周,小鼠生长良好,二组间无差异
(1)于前臂内侧皮内注射孢子丝菌素0.1 ml,48 h观察结果
(4)抗原效价测定:应用lowry法测定2倍稀释抗原液,采用岛津uv-190型分光光度计测定750 nm的吸光度值,作标准曲线经换算得蛋白含量为60 μg/ml
讨论:孢子丝菌病是由申克孢子丝菌引起的慢性深部真菌病主要侵犯皮肤及皮下组织,且可侵犯内脏器官目前诊断该病常用的方法有:皮损渗出液涂片gram及pas染色镜检,直接镜检检出率低,据统计国内自1947～1996年已公开发表的1 647例该病患者中做直接镜检(需取组织块或患处脓液)费时长,至少需1～2周;而儿童患者有相当部分病例(占54.3%)不宜作病理检查孢子丝菌素皮试快速、简便更适于儿童患者应用孢子丝菌素的制备已经历了四个阶段:(1)标准的孢子丝菌素(相当于菌苗制备);(2)液体培养滤液;(3)多糖衍生物的粗制剂;(4)多肽抗原制剂本组即经历了第3阶段,一般认为人体感染申克孢子丝菌后5～15 d即可出现皮试阳性反应因申克孢子的菌与白色念珠菌有相同的抗原决定簇,其相关系数为0.89%,故用白色念珠菌吸收孢子丝菌素,从而有效地清除了二者间的交叉抗原性,故此孢子丝菌素具有高特异性,全部确诊病例皆通过各种手段,相互验证,结果可靠故认为此方法可作为诊断儿童孢子丝菌病的首选方法之一
(2)制定标准:阴性:与溶媒对照类似的帽针大小丘疹或红晕
孢子丝菌素的制备:
(2)无菌测定:无菌操作下抽取上述抗原液分别接种于肉汤培养基及沙氏培养基上,20℃培养2周,观察无细菌及真菌生长
可疑:直径小于0.5 cm的水肿性红斑结果:46例中,孢子丝菌素皮试,真菌培养及病理检查皆做者共21例,不宜作病理检查者25例,孢子丝菌素皮试阳性者共45例,阳性率98%,真菌培养阳性者43例,病理检查为炎性肉芽肿;自然对照组、皮肤癣菌病20例、正常儿童30例皮试结果均阴性全部确诊病例均予10%碘化钾溶液5～10 ml,每日3次口服,经2～4个月治愈,随访半年以上无复发
(1)取我科真菌室保存的申克孢子丝菌菌种,无菌操作下划线法接种于8只250 ml茄瓶沙斜面培养基上,20℃培养2周,长出较厚菌膜用丙酮冲洗,2 h后吹干,获灭活的孢子丝菌干粉参照真菌抗原提取法,取5 g干粉加入250 ml柯卡提取液中,电动玻璃匀浆机研磨(8 000 r/min) 30 min,4℃磁力搅拌器提取72 h,孢子丝菌充分吸收后过滤,滤液透析24 h,校正ph为7.5,负压蔡氏滤器(0.2 μm)过滤除菌,获2倍稀释的孢子丝菌素制剂,4℃冰箱保存备用
(5)抗原液的最后稀释浓度为1∶100,1 ml/g分装后4℃冰箱保存备用
我们研制出精制孢子丝菌素,并对46例孢子丝菌病患儿进行皮试观察,获满意结果,现报道如下
皮试及结果制定:
临床资料:自1988～1996年临床诊为孢子丝菌病的患儿46例其中男27例,女19例;白城地区28例,内蒙地区10例,长春地区8例;年龄最小3个月,最大14岁;病程最短2周,最长6年,平均病期为4个月;分型以固定型居多为32例,淋巴管型10例,皮肤播散型4例;发病部位以面部最多共43例,其中眼睑发病6例,四肢发病仅3例病例确诊依据为孢子丝菌素皮试、真菌培养及病理组织切片he及pas染色,临床特征及治疗效果综合判断临床工作中遇有皮损似孢子丝菌病患儿,孢子丝菌素皮试阴性,病理组织切片排除孢子丝菌病患儿5例,形成自然对照组皮肤癣菌病患儿20例,健康儿童30例
