作者：吴晓雁1，张静2，黄家敏3，孙瑶4，黄晓雯5，高文超1，吴榕1，陈三妹6，黄怀球1
作者单位：1.医院皮肤科，广东广州；2.中医院皮肤科，广东广州；3.医院皮肤科，广东深圳；4.安徽医院皮肤性病科，安徽合肥；5.医院皮肤科，广东广州；6.医院全科医学，广东广州
吴晓雁，张静，黄家敏，等.申克孢子丝菌4Hppd基因结构功能的生物信息学分析［J］.皮肤性病诊疗学杂志，,27（2）：79-82,88.
申克孢子丝菌；对羟苯基丙酮酸双加氧酶基因；生物信息学分析
基金项目：国家自然科学基金（编号：；）；中山大学三大建设超算专项（编号：-）
孢子丝菌病是由双相型真菌孢子丝菌复合体感染引起的亚急性、慢性深部真菌病，申克孢子丝菌（Ss.）为我国孢子丝菌病的主要致病菌种之一，其毒力决定因素包括黑色素、双相性等。对羟苯基丙酮酸双加氧酶(4-HppD)是真菌利用酪氨酸的关键酶，为致病真菌在宿主体内生存提供氮源及碳源，其代谢产物参与申克孢子丝菌等真菌脓黑色素的形成。此外，近来研究表明，4-HppD参与双相真菌向致病的酵母相转化，从而阻止中性粒细胞、巨噬细胞及树突状细胞有效清除病原体，使得感染慢性化，具体机制尚不明确。研究表明，非特异性的4-HppD抑制剂对马尔尼菲蓝状菌、构巢曲霉及粗球孢子菌向致病相转化具有显著的抑制作用。然而，4-HppD也参与哺乳动物氨基酸代谢。因此，研究此基因编码蛋白的生物学功能对研究申克孢子丝菌的致病机制及潜在药物作用靶点开发具有重要意义。本研究拟应用生物信息学工具初步探讨Ss.4Hppd编码蛋白的理化性质及功能特征，为后续研究提供参考。方法应用生物信息学在线工具预测分析Ss.4Hppd编码蛋白的理化性质及功能特征。结果1Ss.4Hppd基因鉴定
BLASTx比对结果提示，Ss.4Hppd极有可能编码4-HppD，CDSearch显示Ss.4HppD氨基酸序列的aa49-aa具有4-对羟苯基丙酮酸双加氧酶的结构域特征。2Ss.4HppD的理化性质
Ss.4HppD含个氨基酸残基，相对分子量约52.0kD，酸性氨基酸残基总数（Asp+Glu）为55，碱性氨基酸残基总数（Arg+Lys）为46，理论等电点为5.98，为酸性蛋白质。此外，数目最多的氨基酸为甘氨酸，占10.9%，还含有43个半胱氨酸，占9.0%。假定所有的半胱氨酸均形成二硫键，0.1%浓度的Ss.4HppD水溶液在nm处的吸光度为1.；假定所有的半胱氨酸均不形成二硫键，则0.1%浓度的Ss.4HppD水溶液在nm处的吸光度为1.。Ss.4HppD的N末端为蛋氨酸，在原核及真核表达系统的半衰期均较长；其不稳定系数为47.43，是不稳定蛋白。3Ss.4HppD的二级结构及三级结构
蛋白质的二级结构是依靠氢键形成多肽链骨架原子的稳定结构。Ss.4HppD蛋白二级结构以无规则卷曲和α螺旋为主要二级结构方式。其中，无规则卷曲约占44.03%，主要由aa1-aa32、aa97-aa、aa-aa、aa-aa构成；α螺旋占比约30.19%，主要分为10段，主要位于羧基端；β折叠占比约7.97%；延伸链约16.56%。通过比对，SWISS-MODEL模拟构建Ss.4HppD的三级结构见图。4Ss.4HppD的信号肽、跨膜区域、亚细胞定位
SigalP提示Ss.4HppD不存在信号肽，为非分泌性蛋白。CELLO预测该蛋白定位于线粒体可能性大，TMHMM未发现该蛋白的跨膜区域，预测其不属于跨膜蛋白。5Ss.4HppD的功能域及修饰位点
MotifScan分析提示Ss.4HppD翻译后修饰主要有酰胺化、磷酸化及豆蔻酰化，其中磷酸化修饰位点丰富，包括1处cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸位点、9处酪蛋白Ⅱ激酶磷酸化位点、5处蛋白激酶C磷酸化位点；此外还有7处豆蔻酰化位点和1处酰胺化位点。MotifScan预测Ss.4HppD的羧基端aa-aa含有乙二醛酶功能域。6多重比对
基于Ss.4HppD的氨基酸序列进行BLASTp比对，相似度高的蛋白均为4-HppD，根据积分依次来源于巴西孢子丝菌（Sporothrixbrasiliensis）、Sporothrixinsectorum、同属于壳亚纲长喙壳目的真菌（Ophiostomapiceae及Grosmanniaclavigera），同源蛋白序列分别为：KIH.1、OAA67.1、EPE.1、XP_.1。根据文献检索来源于其他真菌中已验证功能的蛋白质序列：马尔尼菲蓝状菌（Talaromycesmarneffei)、烟曲霉（Aspergillusfumigatus)、粗球孢子菌（Coccidioidesimmitis），分别为XP_.1、XP_.1、XP_.1。不同序列间相似性较高，尤其在aa46-aa94、aa-aa、aa-aa、aa-aa等区域氨基酸序列一致或相似。研究显示，4-HppD是亚铁离子依赖的非血红素加氧酶，可通过DHCVGN及VQHIAL等区域构成活性金属离子结合区域，由H结合金属离子。多重比对结果提示，Ss.4HppD的金属离子结合区域位于aa-aa及aa-aa。结论预测Ss.4HppD位于线粒体中，具有乙二醛酶功能域结构功能特点及丰富修饰位点，可为其表达、晶体结构分析及小分子抑制剂开发提供参考。预览时标签不可点
