导读
宏基因组测序（mNGS）检测总病原体（pan-pathogen）已经成功地应用在了对病因不明的急性疾病患者的检测中，提供了在一次试验中准确地鉴定几乎囊括了所有潜在的病原体（病毒、细菌、真菌和寄生虫）的方法。随着测序技术和生物信息学技术的发展，利用mNGS进行病原体检测展现出广泛的应用前景，但是仍面临着很多挑战：（1）缺乏mNGS临床验证的标准；（2）如何鉴别定植和感染微生物；（3）缺少用于临床诊断的定制生物信息学软件；（4）完善现有数据库的质量和全面性；（5）临床实验室环境的改善。本文开发并验证了一种临床mNGS分析方法，综合诊断引发脑膜炎、脑炎的脑脊液（CSF）感染原因。
点击文末“阅读原文”，可了解更多病原产品
文献ID
题目：Laboratoryvalidationofaclinicalmetagenomicsequencingassayforpathogendetectionincerebrospinalfluid
译文：临床宏基因组测序检测脑脊液病原体的实验验证
期刊名：GenomeresearchIF：9.
年份：
通讯作者：CharlesY.Chiu单位：加利福尼亚大学检验医学系
研究成果
1、样本处理与生信分析
病原体检测从文库构建、测序到生信分析的总体流程如图1所示，并在CLIA（ClinicalLaboratoryImprovementAmendments）认证的实验室中进行了验证。测序过程中，来自8位病人的脑脊液样本的RNA和DNA文库、NTC（无模板对照）、PC（阳性对照）并行进行。步骤包括：（1）微生物富集，（2）核酸提取，（3）通过2轮PCR构建文库，（4）等摩尔浓度文库混合，（5）Illumina测序，每个文库-万个序列（图1AB）。
生信分析流程SURPI+的结果制成了表格，并呈现在一个基于网络的图形用户界面（SURPIviz），以方便实验室医生（比如微生物学家、病理学家）解读mNGS结果（图1C）。结果包括：（1）一个自动化的mNGS结果总结Excel表格，提供QC指标和全面的临床解释（图2A）；（2）每个样本中原始和标准化的read数目热图；（3）可以使用BLASTn获得个体细胞信息，也可以下载FASTA格式手动进行下游分析；（4）与NCBIGenBank核苷酸数据库中最匹配的微生物参考基因组或序列的比对覆盖图（图2C）。在看mNGS检测结果时，实验室医师评估所显示的生物体的临床意义、分类特异性和潜在污染（图2D）。临床报告按类型列出了检测到的微生物（病毒、细菌、真菌或寄生虫），通常附有相关文献的解释和引用。
图1mNGS检测分析流程示意图
图2脑脊液mNGS检测的临床脑膜脑炎患者肠病毒感染的鉴定报告
2、建立报告检测到病原体的阈值
为了减少低水平微生物污染引起的假阳性结果，建立了微生物检测的阈值标准。对于病毒，开发了检测到来自≥3个不同基因组区域的非重叠reads的阈值标准，达到这个阈值的病毒种或属被报告为“检测到”，否则被报告为“未检测到”。对于细菌、真菌和寄生虫的鉴定，开发了每百万reads(RPM)的比率指标，即RPM-r，RPM-r=RPMsample/RPMNTC，最小的RPMNTC设为1。该指标通过对NTC检测到的病原体reads进行归一化来解释低水平的微生物污染。为了确定RPM-r的最佳阈值，用95例临床脑脊液样本进行mNGS准确性评估，绘制了不同RPM-r阈值的受试者工作特征（ROC）曲线，结果表明RPM-r为10时，可最大限度地提高微生物检测的准确性。因此，将RPM-r10设为细菌、真菌和寄生虫的检测阈值，RPM-r≥10为“检测到”，RPM-r10为“未检测到”。
3、检出限（Limitsofdetection，LOD）
计算95%的检出限，即检测到95%阳性样本的最低浓度。评估了PC浓度从0.到0基因组当量/mL，每个生物体最小稀释范围为4-log，每个浓度测3到11个重复。使用概率元分析，确定了PC中7个代表性微生物的95%检出限（表1）。最终的PC由7个微生物组成，它们的浓度在高于95%LOD的0.5-到2-log范围内。
表1mNGS检测性能特征
4、精确度（Precision）
通过对NTC和PC进行20次连续的mNGS测序，证明了实验间的重复性；通过在同一次实验中测试三组独立的NTC和PC，证明了实验内的重复性。每一次实验，内部添加的噬菌体（内标，IC）对照都通过了QC，而且只有一个PCRNA文库的reads数低于万的最低限度。使用预先设定的阈值标准检测所有7个微生物，分别用于实验内和实验间的重复检测（表1）。
5、准确度（Accuracy）
为评估准确度，用mNGS检测了95例脑脊液样本（73例阳性中检测到79个微生物，22例常规临床检测为阴性）。一名获得认证的传染病医师（C.Y.C.）和病理学家（S.M.）独立地进行了深入、回顾性的患者病历回顾，以获得常规临床检测结果和最终的微生物诊断结果。mNGS结果与(1)原始临床试验结果、(2)差异检验后的结果、(3)差异检验及高宿主背景样本排除后的结果进行比较（表1，图3AB）。
总的来说，mNGS检测结果与原始临床试验结果相比，敏感性为73%，特异性为99%（表1，图3B左）。21例被归类为mNGS假阴性（表2），21例中有8例有足够的剩余脑脊液可供差异检测，在这8例mNGS阴性病例中：5例（2例西尼罗河病毒、奇异变形杆菌、近平滑假丝酵母菌、新型隐球菌）经临床随访PCR检测均为阴性，经差异检测后重新归为真阴性（表2，图3B中间）；经后续PCR检测，8例mNGS阴性病例中3例为阳性，因此归为mNGS为假阴性，鹑鸡肠球菌和烟曲霉菌感染可能被mNGS检测遗漏，因为它们是高背景样本且原始的临床检测呈弱阳性，一例申克氏孢子丝菌呈假阴性，因为申克氏孢子丝菌的基因组为32Mb，GenBank参考数据库还没有载入。对于其余的13例mNGS假阴性，检查了临床数据以寻找可能的解释（表2，详见原文）。
图3相对于脑脊液临床检测，mNGS的准确性
表2与最初的临床试验有差异的mNGS阴性结果（n=21）。TN，真阴性；FN，假阴性
6、干扰
评估mNGS实验中人类DNA和RNA、红细胞溶血和同一属的混合菌（金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌）的干扰效应（表1）。添加≥1×cells/mL的外源DNA，导致了大约2-logIC和PCreads数的减少，影响了对PC样本中DNA微生物的检测。较低水平的外源性DNA或RNA的添加对定性检测没有影响。基于干扰的结果，选择了RPM为内标噬菌体的最低阈值，RPM值低于这一阈值表明样本文库有很高的宿主背景，并在报告中解释检测RNA病毒或DNA病毒、细菌、真菌和寄生虫的灵敏度降低的原因。
在准确度研究中，利用来自55个CSF样本的可用数据，评估了与宿主背景水平相关的白细胞计数对IC噬菌体序列检测的影响。ICDNA噬菌体计数RPM的26个样品中，白细胞平均为个细胞/mm3，而ICDNA噬菌体计数RPM的29个样品中，白细胞平均为27个细胞/mm3（双端t检验P=0.）。
严重溶血（深红色脑脊液）导致mNGS检测RNA病毒（PC中的HIV-1）敏感性降低，但不影响DNA病原体的检测敏感性。中度至低度溶血（粉红色至淡红色脑脊液)对任何PC微生物的检测灵敏度均无影响。分析含等效RPM-r值的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌混合样本，发现当以1:1、4:1和1:4的比例混合时，这两个物种都能被正确识别，且计算出的RPM-r值与根据混合比例计算出的值相差不到7%。
7、稳定性
对在4℃条件下分别保存0、2、5和6天后的PC进行分析，并进行三次冻融循环，结果显示所有生物都被检测到（表1）。
8、挑战研究
使用一组20个CSF样本进行mNGS检测的盲实验评估，这些CSF样本是前瞻性收医院（CHCO）的患有脑膜炎、脑炎和/或脊髓炎的儿童患者。mNGS相对于传统临床微生物学检测（培养、血清学和/或PCR）的整体敏感性和特异性分别为92%和96%。在之前的12例阳性病例中，有11例被正确地识别了病原体，包括肠病毒（8例）、HSV-1（1例）、HIV-1（1例）和WNV（1例）。mNGS未能检测到第二例脑脊液IgM阳性患者的WNV。分别来自不同的样品的另外三种微生物（肠杆菌、棒状杆菌和EBV）也被检测到，而之前两份样本经脑脊液培养后均为阴性，故对肠杆菌和棒状杆菌的检测认为是假阳性。脑脊液mNGSEBV检测阳性的患者血液中EBVIgG抗体也呈阳性，但是，由于缺少CSF剩余样本进行确认，这一结果被排除在比较之外。此外，mNGS未能检测到4例在脑脊液以外的其他位点检测到的微生物，包括（血液血清学）伯氏疏螺旋体，两例脑炎支原体（呼吸PCR阳性，但脑脊液PCR阴性），和一个肠病毒71感染（直肠拭子阳性，但脑脊液阴性），这4例也被排除在比较之外。在4例未确诊病例中，包括1例培养阴性细菌性脑膜炎和3例特发性脑炎，mNGS阴性结果与阴性临床试验结果一致。
研究结论
1、开发并验证了一种临床mNGS分析方法，用于诊断因脑脊液感染引起的脑膜炎和脑炎；
2、开发了一个定制的生物信息学管道SURPI+，用于快速分析mNGS数据，自动生成检测到的病原体摘要，并提供图形界面；
3、建立了质量指标、阈值和检测限；
4、总溶血和过量的宿主核酸会降低检测灵敏度，但是加入内标噬菌体，可作为敏感度降低的可靠指标；
5、评价了该方法的准确度、精确度和稳定性等指标。
公司介绍
上海锐翌生物科技有限公司成立于年10月，是一家专业从事基因科技及健康服务的国家高新技术企业。锐翌生物依托高通量测序技术平台，专注于人体微生物组前沿技术和研究成果在基础科研领域的突破，以及在医学上的转化应用。助力高等院校、医院的科研工作者多角度、全面地探究和解决科学问题，助力更多优质科研成果发表。同时，在大肠癌早期筛查、未知病原微生物检测和健康管理等精准医疗领域开发检测技术及应用方案，致力于为医疗机构提供疾病早期检测和健康综合管理服务，目前已和全国医院达成深度合作。
公司于年获评“上海闵行十大科技创业新锐”企业称号，目前已在杭州、青岛、济南、贵阳等地成立区域中心。其中，济南医学检验所于年被授予“国家基因检测技术应用示范中心”称号，青岛医学检验所于年9月投入使用。
供稿：刘婷
编辑：鲁淑妮
点击下方“阅读原文”
了解更多病原产品
怎样治好白癜风北京哪个治白癜风医院比较好
