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内生放线菌如何分离鉴定

探究含有抗肿瘤活性喜树碱的喜树(CamptothecaacuminataDecne.)种子中内生放线菌的多样性,以及从内生放线菌中寻找新型活性化合物产生菌。

利用放线菌富集培养基分离喜树种子内生放线菌,并根据菌落形态及16SrRNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定;以及利用与病原微生物共培养方法检测分离菌株的抗菌活性。

从上海交通大学校园的喜树种子中共分离到33株内生疑似放线菌,经基于16SrRNA基因序列分析的分子鉴定,确定其中21株属于链霉菌,1株属于拟诺卡氏菌,另有3株由于序列相似性低于95%而无法分类;8株因未能克隆16SrRNA基因序列而未确定分类。这11株疑似内生放线菌是否是新放线菌(种)类群,有待后续深入研究。初步的抗细菌、真菌活性检测发现,分离到的内生放线菌中42.42%以上对立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)有很强的抑制菌核形成的作用,54.54%内生菌有较强抑制芽孢杆菌生长的作用。并且挑选其中具有代表性的菌株Streptomycessp.CXSZ1进行代谢产物的分析,初步发现其代谢产物中含有抗细菌活性成分。

喜树种子内生放线菌的分离、鉴定及生物活性物质分离鉴定的研究工作,一方面可以为揭示喜树等高等植物种子内生菌的起源、演化等提供有价值的信息,同时也为新结构、新活性化合物发掘提供实验材料。

植物内生菌长期生活于某种植物内部,因其独特的生存环境,可能进化出与宿主植物类似的代谢途径与产物。近年来,植物内生菌作为一种新的微生物资源,而成为天然产物发掘的热点,并成功筛选到了紫杉醇、鬼臼毒素、长春碱等化合物产生菌。获得特定生物活性物质产生菌,不仅为环保、可持续生产天然产物,及实现规模化生产提供了有利条件;同时,也为复杂天然产物生物合成途径理论研究提供了更好的实验材料。

喜树为我国特有珙桐科高大乔木,其次生代谢产物中的喜树碱(Camptothecin,CPT)通过作用于拓扑异构酶I(TopoI),而诱导细胞凋亡。喜树碱及其衍生物已被广泛应用于肝癌、胃癌、膀胱癌及白血病等的临床治疗。迄今对于喜树内生菌的研究主要集中在内生真菌,并且已经发现了能够产喜树碱的内生真菌;对喜树的根、茎、叶等器官中的内生放线菌已有研究,但对喜树种子内生放线菌的研究尚未见报道。

而种子是植物物种延续的重要繁殖体,种子内生菌因长期、稳定的进化选择,可能比植物其他器官中的内生菌有更高几率演化出与宿主相似的次生代谢途径。本实验试图通过系统分离喜树种子中以放线菌为主的内生菌,了解喜树种子中内生放线菌的群落结构。同时,通过分析喜树种子内生菌的代谢谱,探究喜树种子内次生代谢物质的生源,为寻找新型化合物产生菌和开发利用新型活性物质提供重要的线索。

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