作者：贺莉雅1,黄凯凯1,谢婷1,莫冬冬1,范瑞强1,席丽艳2,3,鲁莎2,陈信生1
作者单位：1.医院皮肤科,广东广州;2.中医院皮肤科,广东广州;3.南医院,广东广州
通信作者：席丽艳，博士，主任医师，教授，博士生导师，E-mail：xiliyan
mail.sysu.edu.cn基金项目：广东省中医药局中医药科研项目();广东省科技计划项目(B)
贺莉雅,黄凯凯,谢婷,等.9种中药单体的体外抗单梗着色霉活性评价[J].皮肤性病诊疗学杂志，,28（4）：-,.
[摘要]目的体外检测中药单体对单梗着色霉的抑菌活性，为临床采用中药治疗着色芽生菌病提供实验依据。方法11株单梗着色霉菌株为实验菌株，包括1株标准株、10株临床分离株。参照CLSI制定的M38-A2，采用微量稀释法检测蛇床子素、姜黄素、白鲜碱、知母皂苷、黄芩苷、苦参碱、丹皮酚、斑蝥素和大黄酚9种中药单体对单梗着色霉的抑制作用。结果9种中药单体最小抑菌浓度（MIC）的几何均数为14.11～.65μg/mL，蛇床子素、姜黄素和白鲜碱的抑菌活性最佳，几何均数分别为14.11、28.21、52.98μg/mL；蛇床子素的抗菌作用最强，MIC范围为8～32μg/mL。9种中药单体最小杀菌浓度(MFC)为~μg/mL；蛇床子素的MFC值最低，几何均数为.65μg/mL。结论蛇床子素、姜黄素、白鲜碱、知母皂苷、黄芩苷、苦参碱、丹皮酚、斑蝥素和大黄酚对单梗着色霉具有一定的抑菌活性，不同中药单体抑菌活性存在差异。
[关键词]单梗着色霉；中药单体；药敏试验
Antifungaleffectsof9ChineseherbalmonomersagainstFonsecaeamonophorainvitro
HELiya1,HUANGKaikai1,XIETing1,MODongdong1,FANRuiqiang1,XILiyan2,3,LUSha2,CHENXinsheng1
1.DepartmentofDermatology，GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou，China;2.DepartmentofDermatology，SunYat-senMemorialHospital，SunYat-senUniversity,Guangzhou，China;3.DermatologyHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,China
Correspondingauthor:XILiyan,E-mail：xiliyan
mail.sysu.edu.cn[Abstract]ObjectiveToevaluateantifungaleffectsof9ChineseherbalmonomersagainstFonsecaeamonophorainvitro,providinganexperimentalevidencefortheclinicaltreatmentofchromoblastomycosiswithChinesemedicine.MethodsTherewere11strainsofFonsecaeamonophora,including1standardstrainand10clinicalisolates.AccordingtotheM38-A2protocolformulatedbyCLSI,themicro-liquid-baseddilutionmethodwasusedtodetecttheantifungaleffectsof9Chineseherbalmonomersagainst11strainsofFonsecaeamonophora.ResultTheMICvalueofthequalitycontrolplantwaswithinthereferencerange,andthepositivecontrolgrewwell.Thegeometricmeanrangeoftheminimuminhibitoryconcentration(MIC)of9kindsoftraditionalChineseherbalmonomerswas14.11～.65μg/mL.Theeffectofosthole,curcuminanddictamninewerethebest,andtheirgeometricmeanwere14.11μg/mL,28.21μg/mLand52.98μg/mL,respectively.OstholehadthestrongestantifungaleffectonFonsecaeamonophora,showingtherangeofMICwas8～32μg/mL.Theminimumfungicidalconcentration(MFC)rangedfromμg/mLtoμg/mL.OstholehadthelowestMFCvalue,andGMMFCwas.65μg/mL.ConclusionOsthole,curcumin,dictamnine,anemarrhenasaponins,baicalin,matrine,paeonol,cantharidinandchrysophanolexhibitsantifungaleffectsagainstFonsecaeamonophora.
[Keywords]Fonsecaeamonophora;Chineseherbalmonomer;antifungaltest
着色芽生菌病（Chromoblastomycosis,CBM）是由致病性暗色真菌侵犯皮肤和皮下组织引起的慢性进行性肉芽肿性真菌病[1]。该病常见于户外工作者，与皮肤外伤有密切关系，好发部位为四肢，特别是小腿和足部。着色芽生菌病在世界各地均有报道，以热带、亚热带地区多见，近年发病率呈上升趋势[2]。我国以广东、山东和河南为高发区，但不同地区病原菌有所不同，北方以卡氏枝孢霉为主，南方则主要为着色霉属，其中以单梗着色霉(Fonsecaeamonophora)最为常见[3]。着色芽生菌病的治疗目前仍为临床难题，需要长期系统应用抗真菌药物或联合用药，面临着治愈率低、复发率高、治疗时间长及系统性抗真菌药物不良反应等困境[4]。目前暂无中药治疗着色芽生菌病的相关报道，本文参照美国临床和实验室标准化研究所(clinicalandlaboratorystandardsinstitute,CLSI)制定的M38-A2方案中的微量基稀释法，检测9种中药单体对单梗着色霉的体外抗真菌作用，旨在筛选出对单梗着色霉具有抑制作用的中药单体,为临床应用中药治疗着色芽生菌病提供实验依据。1材料与方法
1.1菌株来源
单梗着色霉标准株CBS.37、质控株近平滑念株菌ATCC均由中医院医学真菌研究中心提供。10株经形态学及分子生物学方法鉴定为单梗着色霉的临床分离株来自中医院皮肤科。1.2培养基
RPMI-液体培养基:用直径为0.22μm微孔滤膜过滤除菌，４℃备用。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):于℃高压灭菌20min,置于室温放凉备用。1.3药物
蛇床子素、姜黄素、白鲜碱、知母皂苷、黄芩苷、苦参碱、丹皮酚、斑蝥素和大黄酚中药单体购自上海麦克林生化科技有限公司，伊曲康唑购自美国sigma公司，均配制成10.24mg/mL的母液作为储存液。1.4菌悬液的配制
将保存的菌株接种到PDA培养基，35℃复苏7d,再转种于PDA培养基，35℃活化10d，用RPMI-液体培养基冲洗菌落表面收集分生孢子，血细胞计数板计数，用RPMI-液体培养基调整孢子浓度至1×CFU/mL，再稀释50倍，得到终浓度为2×CFU/mL的孢子悬液。1.5药物敏感试验
采用微量液基稀释法，参照CLSI制定的M38-A2标准进行。用RPMI-液体培养基调整各中药单体的起始药物浓度为μg/mL，在无菌96孔细胞培养板第2~10孔中，连续倍比稀释，第11孔为不含药物的生长对照孔，第12孔为不含药物且不含孢子的无菌对照孔。将制备的孢子悬液滴加到第1~11孔，于35℃孵育5d。实验终止后，肉眼观察判断终点，加样孔与生长对照孔比较，％生长被抑制所对应的浓度为此药的最低抑菌浓度（minimalinhibitoryconcentration,MIC）[5]。伊曲康唑作为阳性对照，首孔药物浓度为16μg/mL。实验重复3次。1.6最低杀菌浓度(minimumfungicidalconcentration,MFC)测定
药物敏感实验结束后，将96孔细胞培养板取出，从高于各药对应MIC孔浓度(MIC值需≤μg/mL)的各孔中吸取20μL的液体，均匀涂抹在PDA平板上，同时从生长对照孔取20μL接种于PDA平板上，置于35℃孵育，到生长对照孔的转种培养开始生长时为止，计数平板上的菌落。菌落完全不生长或者生长不足3个的最低药物浓度即为最低杀菌浓度。实验重复3次。1.7质控
以近平滑念珠菌ATCC为质控菌，实验共重复3次，结果一致，表明结果可靠。2结果
2.1微量稀释法检测不同中药单体对11株单梗着色霉的MIC值
9种中药单体MIC50为16~μg/mL，几何均数(geometricalmean,GM)范围为14.11~.65μg/mL（表1）。抑菌作用较强的中药单体为蛇床子素、姜黄素和白鲜碱，MICGM分别为14.11、28.21、52.98μg/mL。知母皂苷、黄芩苷、苦参碱、丹皮酚、斑蝥素和大黄酚对单梗着色霉也具有一定的抑菌活性，MICGM范围为.19~.65μg/mL。阳性对照伊曲康唑对11株单梗着色霉的MIC为0.~0.μg/mL。2.2中药单体对11株单梗着色霉的MFC值分布
9种中药单体对11株单梗着色霉的MFC值均为~μg/mL（表2）。大部分中药单体的MFC值μg/mL。蛇床子素MFC值为~μg/mL，GM为.65μg/mL。阳性对照药伊曲康唑MFC值为0.25~2μg/mL。3讨论
目前用于治疗着色芽生菌病的药物非常有限，主要治疗药物为伊曲康唑和特比萘芬，它们存在不同程度的毒副作用，很多患者不能耐受且易复发[6]。研发或寻找有效、低毒和价廉的抗真菌药物迫在眉睫。中药资源广泛，历史悠久。筛选具有抗真菌作用的中药单体，提取有效的活性成分，具有广阔的前景和深远的意义。
很多中药单体已被证实具有杀菌作用。如蛇床子素对酵母相马尔尼菲篮状菌的MIC为16～64mg/L，对氟康唑天然耐药株的MIC为32mg/L[7]。蛇床子和知母的提取物均对大豆尖孢镰刀菌有抑制作病[8]。姜黄素通过影响申克孢子丝菌细胞壁的几丁质从而产生杀菌作用，并通过了细胞实验和动物实验的验证[9]。白鲜碱与氟康唑对白色念珠菌具有协同作用[10]。黄芩苷通过破坏真菌的细胞壁、细胞膜的完整性,阻碍细胞内外物质交换,降低白色念珠菌线粒体SDH酶的活力,影响氧化磷酸化过程,损伤白色念珠菌线粒体,降低营养物质的吸收,不可逆地抑制核酸、蛋白质、脂类及糖的合成,使白色念珠菌S/G2/M期细胞数下降而发挥药理作用从而抑制白色念珠菌生长[11]。苦参碱1.0~4.0μg/mL能使白色念珠菌细胞膜中的麦角固醇含量和CYP酶活性下降,并有明显的剂量依赖性,说明苦参碱可通过抑制白色念珠菌细胞膜的CYP51酶活性,影响麦角固醇生物合成而发挥其抗真菌活性[12]。大蒜素、小檗碱、苦参碱、蛇床子素和丹皮酚对球形孢子丝菌具有一定的抑菌活性，不同中药单体抑菌活性存在差异[10]。
目前中药对真菌的抑制及其作用机制研究主要集中在酵母菌[14]和皮肤癣菌[15]方面，对着色霉属的研究较少。单梗着色霉是近年才被鉴定的新种[16]，目前国内外暂无文献报道中药单体对单梗着色霉具有抑制作用。结合既往中药单体抗真菌作用的文献报道及中药复方治疗皮肤真菌感染的临床研究结果[17]，本研究选取蛇床子素、姜黄素、白鲜碱、知母皂苷、黄芩苷、苦参碱、丹皮酚、斑蝥素和大黄酚9种中药单体作为研究对象，MIC值结果与MFC值结果一致，表明该9种中药单体对单梗着色霉具有一定的抑菌活性，其中蛇床子素、姜黄素和白鲜碱具有治疗着色芽生菌病的潜力，但与临床常用的抗真菌药物如伊曲康唑的抗菌活性仍有一定差异。说明单独使用中药治疗真菌性皮肤病具有一定局限性。
目前研究发现中药单体对真菌抑制的作用机制主要包括中药单体成分对真菌细胞壁或者细胞膜影响[18]。由此推测，中药单体抑制单梗着色霉的可能机制为通过抑制(1，3)-β-D-葡聚糖合成酶的活性或者通过麦角固醇络合作用影响细胞膜的渗透性，从而导致氧化损伤以及致命的DNA损伤，最终导致细胞凋亡[19]。接下来的研究可进一步探讨中药单体联合抗真菌药物的效果，并评价局部用药的可行性，从而丰富着色芽生菌病的治疗手段。
[参考文献]
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