真菌的这些知识点都要知道！
真菌感染需重视
真菌为人体正常菌群的一部分，在人体口腔、上呼吸道、肠道、泌尿道、皮肤表面均有少量存在，与细菌起着重要的生态平衡作用，当机体免疫力低下或正常菌群相互制约作用失调时，真菌便会大量繁殖，引起疾病。
随着广谱抗生素及免疫抑制剂的广泛应用，侵袭性真菌感染在呼吸科越来越常见。真菌感染的临床地位日益突出，医院感染的重要组成。深部真菌感染如果不及时治疗，就有可能「一着不慎，满盘皆输」。
“（一）临床常见的致病真菌
”常见的感染真菌可以分为致病性真菌和条件性致病性真菌两大类：
致病性真菌：或称传染性真菌，属原发性病原菌，常导致原发性外源性真菌感染，可侵袭免疫功能正常宿主，免疫功能缺陷的患者易致全身播散；病原性真菌主要有组织胞浆菌、球孢子菌、副球孢子菌、皮炎芽生菌、足癣菌和孢子丝菌等。
条件致病性真菌：或称机会性真菌，如念珠菌属、曲霉属、隐球菌属、毛霉和青霉属、根霉属、犁头霉属、镰刀霉及肺孢子菌等。这些多为腐生菌或植物致病菌，对人体的病原性弱，但在宿主存在真菌感染的易患因素时，会导致深部真菌感染。
主要致病性下呼吸道真菌种类如下：
菌类
菌属
菌种
酵母菌
念珠菌
念珠菌(假丝酵母菌)、白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌
非念珠菌
毛孢子菌属：白吉利毛孢子菌、头形毛孢子菌隐球菌属：新生隐球菌酵母属：酿酒酵母菌
霉菌
曲霉
烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、构巢曲霉、白曲霉
非曲霉
接合菌：毛霉、根霉、根毛霉、犁头霉、小克银汉霉
暗色孢霉属：外瓶霉、德氏霉、链格孢霉、离蠕孢霉、凸脐孢霉
青霉菌属：马内菲青霉(属双相型真菌)、橘青霉、产黄青霉、扩展青霉、斜卧青霉、软毛青霉
镰刀霉菌属：串珠镰刀霉、增生镰刀霉
赛多孢霉菌属：尖端赛多孢霉、多有赛多孢霉
链格孢霉菌属：交链孢霉
拟青霉菌属：拟青霉
双相型真菌
球孢子菌
粗球孢子菌、厌酷球孢子菌一．
副球孢子菌
副球孢子菌
组织胞浆菌
组织胞浆菌
孢子丝菌
申克孢子丝菌
芽生菌
皮炎芽生菌
地霉菌
白色地霉菌
类真菌
肺孢子菌、奴卡菌、放线菌、葡萄状菌
表1：临床常见致病真菌
临床上应持续不断地寻找微生物感染证据，应叮嘱患者积极送痰真菌培养加药敏，不仅对诊断有帮助，还对以后的抗真菌靶向治疗有重要的指导作用。
“（二）常用的抗真菌药物
”多烯类抗真菌药物
1、两性霉素B
抗菌谱：两性霉素B于年批准上市后迄今已近半个多世纪，该药几乎对绝大部分真菌均有抗菌活性，对念珠菌、隐球菌、曲霉、双相真菌等均有较强的抑制作用。镰刀菌不敏感，尖端赛多孢霉和毛癣菌则耐药。
两性霉素B不经粘膜吸收．胃肠道只吸收少量，故只有静脉制剂，其半衰期长(24小时)，可每日1次给药。组织穿透力弱，但不易通过血脑屏障进人脑脊液，经单用静滴该药治疗真菌性脑膜炎无效者，可同时鞘内给药。
临床上用于治疗系统性念珠菌病、隐球菌病、特别是隐球菌性脑膜炎，曲霉病、毛霉病、孢子丝均病、镰刀菌病、暗色丝孢霉病、着色芽生菌病、丝孢酵母感染、马内菲青霉病，还可治疗芽生菌病、副球孢子菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病等。
用量：一般从小量开始，初始每日0.5-1mg，加入5%葡萄糖液ml中缓慢静滴，避光，时间不少于6-8h，第2日和第3日各为2mg和5mg，若患者无严重反应，则每天增加5mg。最高剂量成人为50mg。对于绝大多数深部真菌感染，用两性霉素B治疗6-8周，总剂量1-2g。
该药具有剂量依赖性，若血尿素氮和肌酐高于正常，应隔日给药或暂停给药以防出现肾损害。
2、两性霉素B脂类制剂
由于两性霉素B常常引起输液反应及肾损害等毒副反应，两性霉素B脂质体的问世解决了这一问题，该脂质体耐受性良好，凡对两性霉素B疗效不佳及产生严重毒副反应者，可用该制剂。
3、制霉菌素
抗菌谱：体外试验表明，白色念珠菌、新生隐球菌、荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌及皮肤癣菌等均对其敏感。
口服不易吸收，几乎全部从大便中排出，皮肤粘膜用药也不易吸收，故仅用于治疗口腔粘膜、胃肠道及阴道的念珠菌感染。
临床多将其片剂溶于水漱口，用以减少口腔真菌机会性感染的几率和排除痰真菌假阳性可能性。
三唑类药物
1、氟康唑
抗菌谱：为一广谱抗真菌药物，对皮炎芽生菌、粗球孢子菌、荚膜组织胞浆菌有抗菌作用，对新生隐球菌、多数念珠菌和皮肤癣茵有效。对克柔念珠菌和光滑念珠菌不敏感。
氟康陛可供口服或静脉滴注。口服及静脉给药生物利用率相近，超过90％，食物不影响吸收。口服和静脉给药可产生相同的血药浓度，在很大的剂量范围内，血药浓度随剂量的增加而增大。能透过血脑屏障，并可穿人透析液中。与其他唑类抗真菌药物不同，氟康唑的蛋自结合率低(约12％)。
常用剂量：第1天mg，随后每天mg，对重症患者每日剂量可增至mg。治疗侵袭性隐球菌病的常用剂量为每日mg。疗程根据临床治疗反应而确定，隐球菌病的疗程一般不少于为6～8周。预防用药的剂量范围为每日50-mg，具体剂量可根据患者发生真菌感染的危险程度而定。对有严重或迁延性中性粒细胞减少等系统性真菌感染高危因素的患者，推荐预防剂量为每日mg。
2、伊曲康唑：
抗菌谱：包括念珠菌属、曲霉、隐球菌和组织胞浆菌等致病真菌，对镰刀霉活性较低，对毛霉感染无效。
伊物康唑有胶囊、溶液和静脉注射液；其胶囊制剂口服吸收不完全(约55％)，与食物同时服用可以促进其吸收。口服溶液制剂空腹服用较餐后服用的生物利用度高，因此，伊曲康唑口服液最好在空腹时服用；伊曲康唑的蛋白结合率高，广泛分布于各个组织中，在肺、肝脏、骨骼中的药物浓度要比血浆中高2-3倍。
临床可用于曲霉、念珠菌属、隐球菌属和组织胞浆菌等引起的真菌感染的治疗以及曲霉和念珠菌感染的预防。推荐剂量为第1、2天mg/次，每天2次静脉滴注，第3～14天mg静脉滴注，每天1次。输注时间不少于1h。
3、伏立康唑(Vorionazol)
第二代三唑类抗真菌药物，2年上市，具有广谱抗真菌作用，其抗真菌活性较氟康唑强10—倍，抗菌谱对曲霉、隐球菌、念珠菌以及对氟康唑耐药的克柔念珠菌和光滑念珠菌均有杀菌活性。另外还有一些少见的尖端赛多孢霉和链格孢霉属亦有杀菌活性。
剂型分口服片剂(50mg，mg/片)和注射粉针剂(mg/瓶)，第1天静脉给药6mg/kg，(或体重40kg者mg，40kg者mg)，1次/12h；第2天起mg，1次/12h(40kg者减半量)。
临床可用于治疗念珠菌病(包括氟康唑耐药念珠菌引起的感染)、侵袭性曲霉病、镰刀霉引起的感染。
3、泊沙康唑
是一种新型三唑类广谱抗真菌药物，从伊曲康唑结构基础上衍生出来，目前只有口服制剂。
抗菌谱：对念珠菌、新型隐球菌、曲霉菌、毛孢子菌、接合菌、组织胞浆菌、镰刀菌等具有较好的抗真菌活性，但对光滑念珠菌、克柔念珠菌疗效较差。
主要用于治疗曲霉菌、镰刀菌和结合菌等引起的难治性、对其他药物不能耐受或对其他药物耐药的真菌感染。
棘白菌素类药物
为一种新型抗真菌药物，供注射用。本类药物为真菌细胞壁的葡聚糖合成酶抑制剂，抑制真菌细胞壁的合成。对人体的毒性较低。常用的有卡泊芬净、米卡芬净等。
1、卡泊芬净
抗菌谱：对曲霉菌和念珠菌均具有良好抗菌作用，对卡氏孢子虫亦有作用，对氟康唑、两性霉素素B或氟胞嘧啶耐药念菌有作用。但对隐球茵、镰刀茵、毛孢子菌、皮肤癣菌、接合菌等无作用；
本品口服不吸收，静滴后半衰朗9—11小时。第1天70mg，第2天起50mg，1次/d，缓慢静脉滴注1h。
临床主要用于侵袭性曲霉感染经其他抗真菌药物治疗无效或不能耐受者。对那些传统药物治疗无效或不能耐受的侵入性曲霉病患者，卡泊芬净是一种较为安全的替代药。
2、米卡芬净
抗菌谱：对白念珠菌(包括耐氟康唑菌株)和大多数非白念珠菌和曲霉(包括耐两性霉素B的士曲霉)敏感。对新生隐球菌无活性。
临床可用于念珠菌及曲霉所致呼吸道、胃肠道和血液感染的治疗与预防。米卡芬净治疗念珠菌病一般用量为50mg，1次/d，静脉滴注。治疗曲霉菌病一般用量为50-mg，1次/d，静脉滴注。重症和难治性念珠菌病或曲霉病患者，均可根据病情谨慎地增加至mg/d。
作用机理
代表类别
代表药物
作用于细胞膜
麦角固醇结合剂
多烯类
两性霉素B
固醇14-α去甲基酶抑制剂
三唑类
氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑
作用于细胞壁
β-1，3葡聚糖酶抑制剂
棘白菌素类
卡泊芬净、米卡芬净
作用于细胞核
抑制RNA、DNA合成
氟胞嘧啶类
5-氟胞嘧啶
表2：抗真菌药物分类
表3：抗真菌药物抗菌谱。注：-无活性；±可能有活性；+有活性，三线治疗(临床疗效较差)，++有活性，二线用药(临床疗效稍差)；+++有活性，一线用药（临床通常有效）
表4：常用抗真菌药物的药代动力学比较
表5：抗真菌药物安全性比较。注：-无毒性；+轻度；++中度；+++重度；NR为无研究数据
目前临床上应用的系统性抗真菌药物种类较多,这些药物的抗菌谱、作用机制、药代动力学、不良反应特点各有不同，应根据患者的个体化特点合理选用药物，可达到良好的抗菌作用和临床疗效，降低不良反应发生率，减少、避免耐药菌的产生，同时应兼顾药物经济学原则，提高患者的顺应性，减轻患者的医疗负担。
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真菌检测中常见问题专家解答近年来，随着恶性肿瘤的高发、艾滋病的流行、化疗药物、广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂等药物的广泛使用，以及人工导管等侵入性操作、器官移植等有创诊疗技术的应用，由真菌所引起的感染日益成为临床各科室面临的巨大挑战。
为了提高临床诊断水平，加强真菌的检验能力显得至关重要，现在临床微生物实验室有关真菌检验的常见问题汇总如下，供大家学习参考。
1、为什么培养要设定35℃？
实验室通常将孵箱温度设定为35℃，是为了防止温度的波动对细菌或真菌生长的影响。临床常见细菌的最适生长温度为33~37℃(嗜热，嗜中温菌除外，占少数)，设定为35℃时上下波动2℃对培养无影响，如设定为37℃C显然就不合适了。至于真菌培养,要视标本来源而定。
一般怀疑浅部真菌感染的标本如皮屑、甲屑、头屑及毛发等分离培养于26~28℃。来源于人体深部组织的标本如痰、胸腹水、血及骨髓深部脓肿等,建议放35℃培养,是刚离体的标本在35℃更接近于人体温度,其次临床最常见的白念珠菌在35℃能形成更为典型的伪足样菌落,这与血清出芽试验在35℃做是同样的道理。
同时,来源于35℃初分离的光滑念珠菌具有更高的酶活性。怀疑温度型双相真菌感染或个别真菌需要较高温度生长时则需要两种温度同时培养。还要注意培养环境的湿度,一般要求大于60%,如果培养箱的湿度不够,最好在平板附近放置盛有无菌水的容器以保证湿度。
2、CO2对真菌生长影响大吗?
真菌属于异养型微生物，主要从有机化合物中获得碳源,而自养型微生物才需要从CO2中获得碳源，所以真菌一般不需要在二氧化碳环境中培养，而且CO2对真菌的生长和繁殖均不利,但一定浓度可刺激孢子形成。
3、在血培养中培养出真菌2次，但是患儿没有临床表现，而且临床也没用抗真菌药患儿就好了，是考虑污染吗?
这种情况要判断是否为污染菌，调查采血过程是否规范、血瓶转运过程是否符合要求、针孔是否适当封口、转运箱是否受到污染等众多因素，最关键的还是患者的临床表现，如没有真菌感染的症状，要么考虑污染，要么考虑定植(可能性不大)。
4、医院实际工作中做阴道分泌物真菌培养，生化鉴定几乎做不了，很多直接报白念珠菌，这样合适吗？
这样做不合适。目前有些检验科甚至分不清酵母菌和霉菌，在阴道白带、尿液和粪便中镜检发现念珠菌后报告为“找到霉菌”。
霉菌是指丝状多细胞真菌；酵母菌是指单细胞形态的真菌，二者不可混为一谈。阴道中感染的酵母菌大多是白念珠菌，但不排除其他酵母菌。
克柔念珠菌对氟康唑和5-氟胞嘧啶天然耐药，如果遇到类似存在天然耐药的菌株，会影响后续的治疗。
5、痰标本中少量念珠菌需要在报告中体现吗?还是不报告?
标本要求和检验程序用要体现，临床医生会综合考虑。虽然白色念珠菌导致肺部真菌感染的概率很小，遇到痰标本真菌培养中分离出该真菌，还是建议报告，临床医生结合影像学结果综合考虑。
先进性痰标本直接涂片，标本质量合格的情况下，见到真、假菌丝或大量孢子，痰培养有真菌生长，还是要报给临床医生，临床医生会综合考虑的。至于是否要做药敏，可和医生沟通后决定。
①建议留样本前5%苏打水漱口；
②清晨第一口痰；
③连送3d结果是否一致。
最好和临床医生沟通一下,或平时对医生、护士进行标本采集方法的培训。报告之前,结合痰涂片镜检结果,备注标本质量信息及污染可能性。
6、请问一下：前几天遇到一个抽出的脓液标本，打到血培养中，报阳后涂片显示真菌孢子，转种后涂片，形态上圆形，墨汁染色阳性，但是没有莢膜，转种科玛嘉没有颜色，后有白色有点黄色，用某国产鉴定显示近平滑，药敏全耐。问题是:①这个结果可信不?②墨汁用的是普通汁有影响吗?③该如何改进?
墨汁染色是针对标本中怀疑隐球菌属的荚膜进行负染，特别是新生隐球菌才做的试验，对纯培养的隐球菌属不可作为鉴定试验。
(1)将之前的脓液标本做个10%KOH湿片检，寻找真菌孢子和真、假菌丝。
(2)培养结果应该是可信的，最好和临床医生沟通一下，看患者是否有症状。
(3)对某国产品牌不熟悉,鉴定结果和药敏结果不好判断
(4)按照全国操作规程配制念珠菌的鉴定生化管，用原卫生部质控真菌鉴定符合率还是很好的，可以考虑自配生化鉴定管，用质控真菌进行验证。
(5)对每批号的某国产鉴定管用质控真菌进行验证,如果结果符合,应该没问题。
(6)最好参加原卫生部微生物质控培训，无论细菌、酵母菌方面,都会帮助你提高业务水平和验证你所用的试剂质量。
(7)墨汁只要粗细均匀，颗粒越细小越好，推荐曹素功墨汁，试剂公司也有印度墨汁可采购。
7、临床常见痰标本初次检出曲霉后,流程是怎么进行下去的?
(1)痰标本初次培养出丝状真菌菌落，前提是痰标本必须是新鲜的或不能立即送检应4℃冰箱保存。
流程是接受痰标本→镜检→培养→鉴定。
在痰标本合格的情况下,先做个10%KOH湿片镜检,低倍镜寻找真菌菌丝，是透明或暗色，是否有45度分枝。
如果痰标本合格，又找到菌丝，电话联系临床，告诉医生有丝状真菌生长，怀疑是XXXX，容易的直接报告临床，难的点种沙氏琼脂平板或察氏琼脂平板，再做进步鉴定。
(2)若标本不合格或合格但标本中未见菌丝，和临床医生电话沟通，告知有真菌生长，让医生综合考虑。鉴定正常进行,并报告临床,备注不排除污染可能。
8、酵母菌同化试验为什么放28℃而不是35C?同化试验和发酵试验有何区别?为什么教科书上说凡能发酵某种糖，一定能同化该糖，同化某种糖则不一定发酵该糖?
多数酵母菌体外最适生长温度为28-30℃，故其体外试验选用此温度。通话和发酵分别指真菌的有氧呼吸和无氧酵解，前者将糖类分解为二氧化碳和水，后者将糖类分解为二氧化碳和酒精等。
其代谢首先进行的是有氧呼吸获得能量，再进一步进行无氧酵解，这由细菌和真菌的相关酶类决定。酵母菌多数为专性需氧菌，所以其试验设计多以糖同化试验为主。比如隐球酵母只能进行有氧呼吸，所以只能同化葡萄糖而不能发酵，而酿酒酵母可将粮食发酵为酒，既发酵也同化葡萄糖。
9、鉴于目前真菌培养不是很规范，如何选择培养基、温度、报告时间和方式?请讲述实验室的具体流程。
(1)培养基：沙氏葡萄糖琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、脑心浸膏琼脂等适宜真菌生长的培养基，临床疑似酵母菌及酵母样菌感染，有条件实验室可平行接种显色培养基，推荐采用螺口管斜面培养法，标本处理后接种于培养基斜面中下部，真菌绝大多数为需氧菌建议平行接种两管。
(2)培养条件及报告时间：深部真菌28±1℃培养7~14d，如怀疑双相真菌感染，应同时在28士1℃及35士1℃培养。
怀疑罕见真菌慢生长真菌感染或临床已用抗真菌药物时，延长观察时间至少培养4周。
如CSF宜置28℃及35℃两个温度培养至少一周；
痰/尿/粪一般35℃48h即可，如未见丝状真菌生长，则延长培养时间；
组织标本一般30℃，2~4周。
10、是否可以用科玛嘉显色培养基作为真菌初代培养基?
可作为初代培养基之一，建议另外接种沙氏培养基或酵母氮培养基(YPDA)，SDA和YPDA一般是酵母样菌的标准培养基。
11、咽拭子真菌培养有意义吗?
咽拭子培养真菌意义不大，存在定植除非患者有临床表现。
12、请问痰标本念珠菌定植率那么高，痰涂片看到比较多的孢子和假菌丝要怎么报告才比较合理?
个人觉得还是要如实报告临床医生、并将标本质量是否合格告知临床医生，至于是否感染，临床医生会根据影像学资料、患者临床表现等综合考虑的。
13、患者的手上有湿疹一样的丘疹,怀疑真菌感染,请问怎么样采样好?
对于皮损类的标本采集，需要用70%的酒精先将患处消毒处理，再使用已消毒的不锈钢刮刀或外科手术刀在皮损边缘刮取皮屑，装在无菌容器内送检。
14、我们用一次性手套装SDA平板可以吗?
一次性手套无论是PV还是乳胶，都会产生相对低氧的环境，而真菌是需氧菌会影响真菌的生长，不建议这样操作。
可以使用透气性好的胶带(静脉输液固定针头的)封闭平板，注意不要封太死。
15、用的墨汁在显微镜下不是均匀的黑色背景，而是一些细小黑色颗粒，这是不是墨汁的质量不好?还有,生物安全柜、超净工作台和通风柜三者有什么区别?
墨汁本身就是一些细微小颗粒加入溶媒形成的，墨汁质量的好坏在于颗粒的大小和均一性。
一般的墨汁检测隐球菌应该能观察，它只是作为背景,荚膜不染色，为透明的，背景是黑色。
生物安全柜和超净工作台的区别在于风吹的方向：
生物安全柜的风向是先垂直向下再向柜内，经过循环通过HEPA过滤后再排出，柜内形成一个相对负压的环境；
超净工作台的风向是先向下再向外吹，保证柜内的清洁无尘，通常用来配置平板和操作一些简单的分子克隆相关实验。
通风柜是通过风机将柜内的空气排到实验室外，通常用来配置有挥发性的化学品试剂，有害气体排向室外。
16、痰涂片中看到曲霉头，有多大临床意义?毛霉有没有污染可能？或者是定值？在痰里一直检查到青霉菌,没有意义吗?
如果痰标本直接镜检发现曲霉头，那就要考虑是曲霉感染。培养可以确定是哪一种曲霉。
毛霉存在污染的可能性，空气中也可以存在，但又因其高度的侵袭性，报告需谨慎，定值的可能性很小，但操作中污染的情况还是不少的。若标本合格，湿片镜检有90度分枝及粗大、不分隔的菌丝，那就要考虑感染了，否则有污染可能，最好及时联系临床医生。
青霉菌是一种条件致病真菌，如果痰中直接镜检查到菌丝，培养阳性，还是考虑感染。
17、在经验积累的初期，如何得到足够的菌株，用于练习各类染色、阅片呢?
有条件的话，医院真菌室进修学习湿片镜检、真菌鉴定，将保存的菌株分批转种后，仔细研究其菌落颜色、大小质地等变化和镜检变化，并做好笔记。或参加医学真菌专业培训班进行系统学习。
18、如何保存真菌菌株?
最好的方法就是真空干燥、低温冻存。国际菌株保藏机构都是这种方法。
(1)将生长的斜面直接放在-10℃冷冻，表皮癣菌和许多接合菌纲菌种不可用此法保存。
(2)蒸馏水保存法：将生长在马铃薯葡萄糖培养基上的成熟的菌落，刮取菌丝体、芽孢或酵母细胞或利无菌蒸馏水冲洗斜面表面，再以吸管吸取放在无菌小管中，密封阻止蒸发，置于室温保存。
(3)另一种方法为直接加无菌矿物油至霉菌生长的琼脂斜面，至少可保存半年以上。
(4)基础液体培养基中加入15%~30%甘油，将新鲜成熟菌落挑至其中，-80℃保存。
19、一般什么样的患者我们会重点去
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