文献ID
题目：Metagenome-wideassociationstudyofgutmicrobiomerevealednovelaetiologyofrheumatoidarthritisintheJapanesepopulation
译名：对日本人肠道微生物组的宏基因组关联研究揭示了类风湿关节炎的新病因
发表期刊：《ANNALSOFTHERHEUMATICDISEASES》
发表时间：年10月
IF：14.
通讯单位：大阪大学医学研究生院
通讯作者：Yukinoriokada
DOI：10./annrheumdis--
背景
人体微生物组是指定植于人体的所有微生物的总和，它对人体免疫系统和新陈代谢具有重要的影响。类风湿性关节炎(RA)是一种以滑膜炎症和关节损伤为特征的自身免疫性疾病。除了环境和遗传因素外，微生物组已成为RA发病的一个候选因素。体内不同部位如肠道、口腔和肺部的微生物都与RA有关。目前已报道了几种导致RA免疫功能异常的机制(如牙龈卟啉单胞菌Porphyromonasgingivalis产生的瓜氨酸肽，Prevotellacopri通过Th17细胞激活免疫反应)。然而，与微生物组相关的RA的病因学仍然是未知的。此外，虽然种族和饮食习惯是导致微生物组组成差异的主要因素，但在非欧洲或非西方人群中，很少有针对RA的人群特异性微生物组研究。
微生物组研究在学术界和工业界的普及，促进了生物信息学的发展。虽然这些方法最初侧重于16SrDNA的扩增子测序，现在基于对微生物组的全基因组鸟枪法测序，推荐进行宏基因组关联研究（MWAS，metagenome-wideassociationstudies）。该方法可在种水平(包括细菌、古菌、真菌和病毒)检测微生物组的组成，并分析其生物学功能特征。因此，鸟枪法测序有望为药物治疗以及粪便移植提供新的靶点。
如前所述，鸟枪法测序的好处是可以深入了解微生物的功能信息。RA是近年来全基因组关联研究（GWAS，genome-wideassociationstudies）中发现的具有代表性的疾病之一，其致病原已被阐明。然而，宿主遗传因子与微生物组之间的联系，至今尚未得到充分的评价。
对物种或基因进行无监督聚类分析，以掌握宏基因组的整体系统发育或功能信息。机器学习是当今发展最快的技术之一。已经使用了各种包含机器学习方法的聚类方法，如主成分分析(PCA)和k-均值方法，但这些经典方法大多假设微生物组数据是呈线性分布的。近年来，发展起来一种非线性降维方法，统一流形逼近与投影(UMAP，UniformManifoldApproximationandProjection)。这种非线性机器学习方法的应用将有助于我们对宏基因组的深入理解。
实验设计
85名RA患者样医院、医院组织大阪南医医院。RA患者根据美国风湿病学会/欧洲风湿病联盟年RA1标准进行诊断。
排除标准：
1.极端饮食(如严格素食者)；2.采样前至少3个月使用抗生素治疗；3.有心脏、肝脏或肾脏恶性肿瘤或严重疾病史。
42名健康对照者的样本来自于医院大阪南医学中心和大阪大学医学研究生院。
所有采集的粪便样本做宏基因组测序。
研究人群的特征
生信分析流程
结果
1.在RA患者的肠道中有大量属于普氏菌属Prevotella的物种
使用广义线性回归模型进行系统发育分析找到了9个进化枝在RA组和对照组中具有显著相关性。
值得注意的是，与对照组相比，这9个进化枝在RA组中都有增加的。如系统发育树所示，表明RA组和对照组的关联结果具有多层次的分类学意义。
在9个进化枝中，8个进化枝属于种水平。大部分RA相关的进化枝属于Prevotella。
2.利用非线性机器学习方法寻找重要的分类群
我们对宏基因组数据进行基于机器学习的去卷积，以全面评估RA组和对照组在种水平上的差异。首先，我们采用UMAP将复杂的物种相对丰度数据去卷积为二维数据。
随后，我们使用基于密度的空间聚类算法(DBSCAN)对UMAP的结果进行无监督聚类，将物种划分为14个聚类。
接下来，我们评估了在系统发育相关试验中，每个聚类中包含有显著差异的物种的程度。超几何检验显示，其中一个聚类中包含了许多在RA组和对照组间具有差异的物种。
8个在RA组和对照组中具有显著差异的种中，有一半属于这一类群（n=4），而且，属于该聚类的物种总数在组间也表现出显著差异。
我们将PCA、NMDS等经典线性机器学习方法以相同的方式并行应用，但聚类去卷积不清晰，没有聚类出现显著差异。
这些结果表明，非线性机器学习方法可以有效地为宏基因组分析提供新的方法。
3.RA组中与氧化还原反应相关的基因减少
为了评估RA患者肠道菌群的功能，我们按照以下步骤进行宏基因组分析：(1)从头组装，(2)开放阅读框(ORFs)的预测，(3)ORFs的聚类和注释，(4)read映射到组装的contigs。
我们分别选择了由UniRef90和KEGG数据库注释的个和个基因。RA组和对照组的基因关联试验采用广义线性回归模型，共发现12个基因有显著关联(UniRef90基因1个，KEGG基因11个)。
其中9个在RA组中与对照组相比具有更高的丰度。其中1个基因显示出高度显著的相关性。R6FCZ7在UniRef数据库中被注释为FeS组装硫利用因子系统蛋白;它还没有得到命名委员会的正式基因名称。这种蛋白具有广泛的细菌功能，如电子转移、氧化还原催化和基因调控等。已有研究报道活性氧在RA发病机制中起重要作用。在分类学上，R6FCZ7的来源菌株为Bacteroidessp.CAG:。在我们的宏基因组数据中，R6FCZ7序列进一步与Bacteroidesuniformis，B.rodentium，B.fragilis，Bacteroidessp的参考基因组相联系。这意味着，Bacteroides的这几个物种具有这种基因的功能。
总之，我们的结果表明，微生物组的氧化还原功能，特别是Bacteroides，可能在RA的病理中发挥重要作用。
4.代谢通路的鉴定有助于RA的病理生理学研究
利用MWAS的基因分析部分的结果，进行基因集富集分析，我们找到了19个显著相关的GO。
其中一个GO是金属离子结合,这意味着活性氧和金属离子之间的相互作用与RA的病理有关。8条KEGG通路有显著相关性。
与这些通路相关的部分物质参与了RA的病理生理过程：(1)脂肪酸已被发现与炎症有关，血清中几种游离脂肪酸被报道在RA患者中上调。(2)萜类化合物抑制核因子-kB信号，是炎症性疾病发病机制中的主要调节因子。它们是雷公藤的主要成分，雷公藤在治疗RA方面不逊于甲氨蝶呤。(3)有报道称脂肪细胞因子参与了RA的促炎状态，增加了RA患者的滑膜液。(4)粘多糖(GAGs)是关节软骨和其他软结缔组织的主要成分。GAG代谢的修饰可能在RA发病机制中起着重要作用。
这些结果提示肠内上述物质可能影响RA的病理改变。KEGG代谢通路的系统分析表明，包括与代谢相关在内的多种通路在组间存在显著差异。
5.RA中宿主基因组与宏基因组间的种群特异性共享生物学通路
我们评估了在RA中肠道菌群宏基因组和宿主种系基因组的生物学通路是否共享。除了对日本人群RA肠道宏基因组的KEGG通路富集外，我们还利用之前在东亚和欧洲人群中进行的RAGWAS数据(n=和n=)估计了RA样本的宿主基因组中的通路富集。我们注意到东亚RAGWAS的大多数受试者是日本人(93.1%)。我们比较了日本人RAMWAS数据和东亚人以及欧洲人RAGWAS数据共享的KEGG通路的p值。
几条通路显示了宏基因组和宿主基因组之间的显著富集(如FoxO信号通路、Th17细胞分化、白细胞介素-17信号通路等)。
我们观察到东亚人的代谢通路之间存在显著的相关性，而欧洲人的没有显著相关性。考虑到MWAS-GWAS通路相关性是在比较相似群体的宏基因组和宿主基因组数据时观察到的，因此在RA病理中，生殖系基因组和宏基因组之间应该存在群体特异性的联系。
6.RA组与对照组的宏基因组多样性无显著差异
RA患者肠道菌群的多样性仍存在争议。因此，我们评估了系统发育数据(门、纲、目、科、属、种6个水平的系统发育相对丰度)和功能数据(基于UniRef90蛋白和KEGG基因数据库的基因丰度)中的α多样性和β多样性。
基于Shannon指数的α多样性的比较在组间没有显著差异。
在β多样性方面，两组的系统发育数据均无显著差异，基因丰度也无显著差异。
总的来说，RA组与对照组在宏基因组多样性方面没有显著差异。
讨论
我们的MWAS分析的基因和通路元件成功地证明了RA肠道宏基因组的新功能。一个代表性的发现是Bacteroides的氧化还原反应相关基因在RA组中的减少。此前有报道称，RA患者肠道内的Prevotella和Bacteroides的丰度呈反比。RA组中几种Prevotella的增加进一步表明这两个主要类群在遗传功能和组成上的平衡反映了RA肠道宏基因组的疾病特异性特征。
过去对于宏基因组和宿主基因组之间的整体联系的研究主要在健康人身上进行，很少有专门针对特定疾病的研究。我们的MWAS-GWAS相互作用分析表明，在RA病理中，种系基因组与宏基因组之间存在群体特异性的通路连接。进一步研究检测到的通路的生物学作用，以及在其他独立人群或其他疾病中验证这些发现是必要的。此外，考虑到人白细胞抗原(HLA)表型在RA病因学中的重要作用，研究HLA表型与宏基因组多样性之间的联系也是有必要的。
综上所述，我们在日本RA人群中基于鸟枪法测序的综合MWAS揭示了肠道微生物组、宿主基因组和RA病理之间的新联系。除了对RA肠道微生物组提供新的见解外，我们的研究还将为未来的功能研究提供有用的资源，以进一步阐明RA病因学中微生物组的作用细节。
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