MetagenomicRecoveryofPhageGenomesofUnculturedFreshwaterActinobacteria
杂志：TheISMEJournal
影响因子（IF）：9.发表时间：
DOI：10./ismej..
研究背景
放线菌是淡水中数量最多、分布最为广泛、且大多数都难以进行纯培养的一类微生物。因此，侵染放线菌的噬菌体也仍然有很多是未知的。目前淡水侵染微生物的噬菌体中仅仅只有一些噬藻体病毒基因组被描述过，其中有六个来自于纯培养，少数来自于宏基因组的组装。然而，侵染淡水中其它主要门类细菌的噬菌体，如放线菌噬菌体仍然未被探索过。在过去的研究中，宏基因组的方法曾用于重建盐湖、海水以及人类肠道中的噬菌体基因组。因此，本研究中研究人员也采用了深度宏基因组测序的方法来重建淡水中放线菌噬菌体的基因组。
实验设计
本研究采集了西班牙阿利坎特市的Amadorio水库的两个水样。第一个50L水样采集于年2月1日，深度为10米，分别用20μm，5μm和0.1μm的滤膜进行过滤，然后提取5μm和0.1μm滤膜上的DNA，用IlluminaHiSeq进行宏基因组测序；第二个50L水样采集于年2月3日，同一地点，水深为17米，分别用20μm，5μm和0.22μm的滤膜进行过滤，提取0.22μm滤膜上的DNA，构建fosmid文库，用IlluminaHiSeq对每个fosmid进行80-x深度测序。
随后进行基因组拼接，去掉小于10kb的contigs，将双端重叠达到50bp的contigs挑选出来，用隐马尔科夫模型与POG数据库进行比对，然后用放线菌门噬菌体特定基因whiB基因进行检测，最终有8个基因组保留下来。对这8个基因组进行基因注释，建立TerL基因的系统发育树；通过Tapemeasureproteins的检测以及与现有的病毒基因组进行比对，来确定8个噬菌体的分类。为确定8个噬菌体的潜在的宿主，研究人员分别使用对宿主的CRISPR-Cas检测，attP与attB检测，噬菌体和放线菌核酸与蛋白水平的比对等方法。
作者从以往研究中获取了全世界各地淡水宏基因组的数据，将该放线菌基因组以及放线菌噬菌体基因组与这些数据进行比对，计算比对上（identity95%，50bp长度）的序列大小占总序列大小的比例。
主要结果
1放线菌噬菌体基因组的种类与数量
研究人员通过对whiB基因的检测，共发现了8个完整的放线菌噬菌体的基因组。通过对这8个噬菌体全蛋白组的相互比较，8个噬菌体可以分为4个groups（图一a）；对这8个噬菌体的TerL基因进行系统发育分析显示这8个噬菌体可以聚成4类（G1-G4）。8个噬菌体中基因组最短的是bp，是G4中仅有的一个噬菌体（图一b），最长的是bp，是G1中仅有的一个噬菌体（图一c），其余的G2和G3分别包含3个噬菌体。G2中的3个噬菌体与放线菌中的acI-A7的核酸与翻译后核酸的比对具有较好比对结果，表明淡水中放线菌类群acI-A是G2噬菌体的潜在的宿主。
图一8个放线菌噬菌体的分类以及G1和G4的基因组的结构。（a）8个放线菌噬菌体全蛋白组的比对结果。（b）G4包含的放线菌噬菌体的基因组的结构。（c）G1包含的放线菌噬菌体的结构。能够被注释到的蛋白的功能用蓝色进行标记，不能注释到的用灰色进行标记；长度比例在中部靠右的地方进行显示，在文章有讨论的基因用下划线进行标识。
2淡水中放线菌噬菌体的丰度和全球分布
通过将8个噬菌体基因组与全世界宏基因组数据进行比对，结果显示8个噬菌体基因组在Amadorio水库中有较高的丰度，但是在其它的点丰度很低（图二）。而与此相反的是，虽然部分放线菌基因组在其被发现的地点丰度最高，但其它点丰度很低；但也有一些放线菌基因组在发现点之外的点丰度也很高。噬菌体的这种在时空上具有很大特异性的分布模式与海洋中同一种噬菌体能够在不同点都有较高丰度的分布模式大相径庭；研究人员认为这可能是与海水不断循环流动有关，而淡水生境是不相连的，在不同的点，其生境具有很大的异质性。
图二放线菌基因组和放线菌噬菌体基因组在全世界各地丰度分布
3噬菌体编码ADP-核糖转移酶毒素
研究人员在G1放线菌噬菌体基因组中发现了包含编码ADP-核糖转移酶所需要的所有标志性位点和活性位点。ADP-核糖转移酶是一种AB毒素（图一），AB毒素的原理是当受体与B端进行结合时，将会促进AB毒素中的A端进入到原核细胞的细胞质中，通过对目标蛋白进行ADP-基化来发挥毒性。真核食菌细胞是AB毒素的天然目标，它们通过限制真核细胞骨架肌动蛋白的聚合来导致细胞凋亡。有研究表明，当大肠杆菌被能够编码Shiga毒素（一种AB毒素）的噬菌体侵染之后，如果其进一步被阿米巴吞噬，将导致阿米巴的死亡。考虑到噬菌体对细菌侵染的高频率特性，因此G1放线菌噬菌体能够显著影响淡水中超过一半的放线菌。由于G1侵染的放线菌被真核生物吞噬之后能够导致真核生物的死亡，因此，G1侵染放线菌能够在一定程度上保护宿主的群落。
结论
文章结果证实了淡水中放线菌噬菌体的存在，揭示了放线菌噬菌体在淡水中与海洋有着截然不同的分布模式。同时，G1噬菌体能够编码ADP-核糖转移酶毒素也为放线菌和放线菌噬菌体适应环境提供了一种方法。
美格基因
发现微生物之美
